基于前表面熒光光譜技術的隱性孔雀石綠快速檢測方法

阮媚，黃海峰，王宇，謝泓，陳秀珊，劉鳳銀，穆洪濤＊

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303；2.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

孔雀石綠（Malachite green，MG）對人類細胞具有致突變性、致癌性，屬于第二類致癌物，會對人類的身體健康造成極大的影響。孔雀石綠在環境中能代謝為脂溶性的隱性孔雀石綠（Leuco malachite Green，LMG），能長期殘留在水產品中具有高殘留及高毒性，對人體造成更大的危害，其結構如圖1所示。我國于2002年頒布《無公害食品標準水產品中漁藥殘留限量》（NY 5070-2002），明確指出孔雀石綠在水產品中不得檢出[1]。國家已明令禁止，但因保證水產品在市場上的鮮活度，其使用仍舊非常普遍。目前，國內報道檢測水產品中的MG和LMG的方法有高效液相色譜法[2]、分光光度法[3]、液相色譜質譜聯用檢測法[4]、酶聯免疫檢測法[5]和表面增強拉曼光譜法[6]等。但實際檢測中主要采用液相色譜質譜聯用檢測法，如 GB/T 19857-2005、SN/T 1479-2004 和SC/T 3021-2003。液相色譜質譜聯用檢測法具有高靈敏度、高準確率等特點，但其前處理操作步驟復雜繁瑣，耗時長，且需要較昂貴的分析儀器，檢測過程復雜，對檢測技術的要求較高，難以對大批量水產品進行分析，不適于普查。

圖1 隱性孔雀石綠（LMG）的結構

前表面熒光技術是一種廣泛應用食品化學和生物科學領域中固體和非透明液體等樣品的熒光數據的檢測方法，其高靈敏性、特異性和無損的特點在食品化學研究中起著極其重要的作用[7]。前表面熒光在食品化學領域已經應用于紅酒鑒定、紅酒中多酚的定量、牛乳的變化、鱈魚魚片儲存過程中的變化和橙汁等方面。LMG具有熒光特征，且具有較明顯的熒光特征峰。應用前表面熒光技術可對水產品中LMG殘留進行快速無損檢測建立新的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

RF-5301PC島津熒光分光光度計：購自杭州英斯特科技有限公司；FA1004B電子分析天平（0.1 mg）：購自上海平軒科學儀器有限公司；賽洛捷克Scilogex MX-F 旋渦混合器：購自上海偉進生物科技有限公司。

隱性孔雀石綠（源葉生物科技有限公司），乙腈（北京伊諾凱科技有限公司），苯、甲苯、石油醚（廣州化學試劑有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

選取乙腈作為隱性孔雀石綠標準液配制的溶劑，準確稱取0.0040 g隱性孔雀石綠顆粒于離心管中并用錫箔紙緊密包裹，防止隱性孔雀石綠光解為其他物質[8]；將隱性孔雀石綠溶于4 mL乙腈溶液中，得到1 mg/mL的隱性孔雀石綠乙腈儲備液，再用該溶液稀釋配制成質量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/L 和 100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標準液，待用。

1.2.2 最佳波長的確定

采集100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標準液的最佳激發波長（Excitation，EX）和發射波長（Emission，EM）。光譜掃描范圍：激發波長范圍為220～420 nm，發射波長范圍為220～620 nm，狹縫寬度為λex=5nm，λem=5nm，使用四面透光石英比色皿。

1.2.3 前表面熒光光譜技術與透射熒光光譜技術的對比

選用100 μg/L的乙腈隱性孔雀石綠標準液，置于4 mL比色皿中，分別用透射和前表面光譜法進行掃描。于激發波長為220～420 nm，發射波長為220～620 nm內測定光譜圖。

1.2.4 溶劑優化

準確稱取4份0.0040 g隱性孔雀石綠顆粒置于4 mL離心管中，分別加入4 mL苯、甲苯、石油醚、乙腈溶劑，振蕩搖勻，按1.2.1的方法配制不同溶劑的孔雀石綠儲備液，再移取配制好的4種儲備液稀釋配制成100μg/L的隱性孔雀石綠標準溶液以及4種空白溶劑，置于比色皿中，掃描熒光光譜圖。

1.2.5 標準曲線的繪制

采用優化后的最佳測試條件，分別測定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/L和100 μg/L的隱性孔雀石綠乙腈標準液的熒光強度。以隱性孔雀石綠乙腈標準液的熒光強度為縱坐標，隱性孔雀石綠乙腈標準液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 數據分析

對獲得的原始熒光數據進行處理，并對試驗數據進行分析，數據繪圖軟件選用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果和討論

2.1 LMG的最佳波長

在激發波長范圍220～420 nm、增量5 nm，發射波長范圍220～620 nm、增量5 nm，掃描的狹縫為5 nm，掃描隱性孔雀石綠（LMG）熒光吸收光譜，如圖2所示。在吸收光譜中最大熒光強度（吸光值）對應的熒光波長稱為最佳熒光波長，隱性孔雀石綠（LMG）最佳的激發波長為265 nm，發射波長為360 nm。

圖2 100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標準液掃描光譜

2.2 前表面熒光光譜技術與透射熒光光譜技術的對比

圖3a和圖3b分別為前表面熒光和透射熒光光譜圖對應的等高線光譜圖，橫坐標為熒光發射波長，縱坐標為激發波長，在λem-λex構成的等高線自外向內表示熒光強度逐漸增強，每條等高線為50熒光強度。在同一條件下，LMG乙腈溶液的前表面熒光光譜對應的等高線光譜圖3a比熒光透射光譜對應的等高線光譜圖3b的圈數多，即前表面熒光技術比熒光透射更為靈敏。

圖3 100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標準液的等高線譜圖

2.3 最佳溶劑的優化

如圖4所示，在萃取劑體積固定的情況下，分別用苯、甲苯、乙醚和乙腈對LMG進行萃取，配制成100 μg/L的乙腈萃取溶液并用前表面熒光掃描得到相應的等高線譜圖，結果顯示苯和甲苯中LMG的熒光峰出現偏移。王碧等[9]人通過對苯系物三維熒光光譜特征的研究，提出了苯、甲苯均有一個明顯的熒光峰，均與MG特征峰位置相接近，由此產生溶劑效應。由此可分析，用苯、甲苯作為孔雀石綠的溶劑時，孔雀石綠中的熒光體與兩種溶劑中的熒光體相互產生干擾，導致了孔雀石綠熒光特征峰的偏移。乙醚存在比較多雜峰，且與隱性孔雀石綠（LMG）峰出現了重疊現象，宋春元等[10]經過多次實驗發現在發射波長290～ 345 nm 范圍內乙醚的水溶液存在熒光譜帶，在這一范圍內存在許多乙醚熒光峰，對判斷隱性孔雀石綠熒光峰產生了干擾。所以乙腈的萃取效果優于其他有機溶劑體系。

2.4 LMG溶液的標準曲線

在優化的方法條件下，選擇最佳的激發波長λex=265 nm，最佳發射波長 λem=360 nm，以隱性孔雀石綠標準溶液濃度為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖5所示。線性方程為Y=3.5318X+13.069，線性范圍為 0.25 ～ 100 μg/L，相關系數R2=0.9974，在空白乙腈中添加LMG標準樣品，以S/N=1.435時對應的質量濃度為方法的檢出限，乙腈中LMG的最低檢出限為14.35 μg/L，低于這個濃度時，隱性孔雀石綠的熒光特性受濃度與光照的影響，其熒光特性產生巨大的變化，影響檢測結果。本研究方法具有快速、靈敏度高的特點，基于此方法可判定乙腈萃取水產品中LMG的殘留量，具有較高的準確度和精密度。

圖4 不同萃取劑及100μg/L隱性孔雀石綠乙腈標準液等高線譜圖

圖5 隱性孔雀石綠的標準曲線

3 討論

目前，國內檢測的水產品中的MG和LMG的常用檢測方法有高效液相色譜法、分光光度法和酶聯免疫檢測法等。實際檢測中主要采用液相色譜質譜聯用檢測法，在測定時須將代謝產物LMG時需氧化還原成MG，該檢測過程頗為復雜，耗時長、耗量大且只能利用保留時間來定性，有一定的局限性[13]；采用分光光度計一般只用于檢測水體中的LMG，其靈敏度較低，準確度較差；酶聯免疫檢測法主要用于的商品化的ELISA檢測試劑盒，以MG為靶標，不能直接檢測LMG，因而需將LMG轉變成MG，使樣品前處理變得復雜，且轉化率難以控制[14]。前表面熒光光譜具有前處理簡單、快速、靈敏度高、成本低、檢測限量低等優點，適用于檢測LMG在水產品中的殘留量。

前表面熒光光譜法容易受到許多因素的影響，例如濃度、分子環境和光學散射等。因此，利用前表面熒光激發-發射光譜研究隱性孔雀石綠（LMG）的熒光特性時，需先選擇LMG的最佳波長，減少誤差。在樣品優化條件下，隱性孔雀石綠乙腈標準液的濃度與熒光強度具有良好的線性關系，為檢測隱性孔雀石綠的殘留提供新的技術手段。

本研究基于前表面熒光技術研究隱性孔雀石綠（LMG），是為了能快速檢測隱性孔雀石綠，節省資源并對建立快速檢測水產中的隱性孔雀石綠的提供方法。

4 結論

基于前表面熒光光譜法檢測隱性孔雀石綠，測定的最佳激發波長為265 nm，最佳發射波長為360 nm。以苯、甲苯、乙醚和乙腈為萃取劑，可判定乙腈作為LMG的萃取劑較為合適。在優化的條件下，本研究方法的線性范圍為0.25～100μg/L，線性方程為Y=3.5318X+13.069，線性范圍為0.25～100μg/L，相關系數R2=0.9974，最低檢出限為0.25μg/L。為檢測水產品中隱性孔雀石綠（LMG）的殘留提供新的技術手段。