國產Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米對草地貪夜蛾的抗性測定

張丹丹 吳孔明

摘要 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是世界性重大農業害蟲。種植轉基因Bt作物是主要的防治手段之一。我們利用室內生物測定方法評價了國產Bt-Cry1Ab玉米（轉化體C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（轉化體DBN3601和DBN3608）對草地貪夜蛾1～4齡幼蟲的毒力。結果顯示，供試兩種轉基因玉米共6個品種皆可高效表達目標殺蟲蛋白并對草地貪夜蛾具有很強的毒殺作用，對1齡幼蟲的致死率達到59%～100%，存活幼蟲的生長發育亦受到顯著抑制。表明國內研發的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對草地貪夜蛾具有良好的控制效果，其中Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米的防治效果顯著優于Bt-Cry1Ab玉米，兩種轉基因玉米皆具有較好的商業化應用前景。

關鍵詞 草地貪夜蛾; Bt-Cry1Ab玉米; Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米; 控制效果

中圖分類號： S 435.132

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019251

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是一種原分布于美洲大陸熱帶和亞熱帶地區的雜食性害蟲[1]，其寄主植物多達76個科，353種[2]。同其他重大遷飛性農業害蟲一樣，具有“國際性、遷飛性、暴發性和毀滅性”的特點[3]，目前已成為世界范圍內嚴重威脅糧食安全的重大生物災害。其幼蟲取食為害玉米，低齡幼蟲取食玉米葉片可造成“窗孔”形癥狀。高齡幼蟲除了取食葉片造成孔洞外，還為害心葉、葉鞘、雄穗和果穗等部位[4]，對玉米產量造成嚴重影響。據報道，20世紀60年代，在阿根廷東北部，草地貪夜蛾造成玉米產量損失高達70%。2000年，在阿根廷西北部地區，被草地貪夜蛾為害的玉米植株所占比例高達71%[5]。在巴西，草地貪夜蛾可使玉米減產34%，每年造成近4億美元的經濟損失[6]。2018年，在非洲西部的加納，草地貪夜蛾造成玉米產量平均損失26.6%（最高40%），經濟損失1.77億美元，在非洲中南部的贊比亞，造成玉米產量平均損失35%（最高50%），經濟損失1.59億美元[78]。

化學防治是控制草地貪夜蛾為害的主要方法[9]，但由于草地貪夜蛾幼蟲常在玉米葉背面和心葉里取食為害，高齡幼蟲甚至會鉆蛀到植株內部，使藥劑無法充分接觸到蟲體，往往達不到良好的防控效果[10]。同時，隨著化學殺蟲劑的持續頻繁使用，草地貪夜蛾種群逐漸產生了抗藥性，據報道，在美洲部分地區，草地貪夜蛾已對氨基甲酸酯類、有機磷酸酯類和擬除蟲菊酯類農藥產生抗性[8]，導致化學防治效果不斷降低。

隨著科學技術的發展，轉基因抗蟲玉米的研發和商業化種植為控制草地貪夜蛾開辟了新途徑，且已成為美洲大陸熱帶和亞熱帶地區防控草地貪夜蛾應用最廣泛的技術手段。目前為止，表達Cry1F、Cry1Ab或Cry1A.105+Cry2Ab2蛋白的Bt玉米已在美國、加拿大和南美部分國家商業化種植，其中，Cry1F玉米‘TC1507的種植最為廣泛[11]。在南非，2018年11月，草地貪夜蛾被列為表達Cry1A.105+Cry2Ab2蛋白的‘MON89034玉米（Bt2）的靶標害蟲[12]。目前在美洲或非洲批準種植的轉基因抗蟲玉米有‘MON810、‘Bt11、‘MON89034、‘MON89034×TC1507、‘MIR162、‘Bt11×MIR162和‘MON810×TC1507×MIR162等，表達的蛋白類型有Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab2、Cry1A.105和Vip3Aa20[10]。

草地貪夜蛾于2019年1月侵入我國云南省[13]，截至5月10日，已在云南、廣西、廣東、貴州、湖南、海南、福建、浙江、湖北、四川、江西13省（區）261個縣（市、區）發現其為害，總發生面積超過6.7萬hm2，已對我國玉米生產構成重大威脅。根據取食寄主植物的嗜好性，草地貪夜蛾被分為喜歡取食玉米的“玉米型”和喜食水稻的“水稻型”[1415]。對入侵種群的分子鑒定結果顯示，目前我國各地草地貪夜蛾均為玉米型[16]。為了發展防治草地貪夜蛾新技術，我們在室內利用人工接蟲至玉米葉片的方法測定了國產Bt-Cry1Ab（轉化體C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（轉化體DBN3601和DBN3608）對草地貪夜蛾1～4齡幼蟲的抗性效果。

1 材料與方法

1.1 供試Bt玉米

Bt玉米由北京大北農生物技術有限公司提供，其中‘C0030.3.5-鄭單958和‘C0030.3.5-農華106是Bt-Cry1Ab單基因抗蟲玉米，‘DBN3601-鄭單958、‘DBN3608-鄭單958、‘DBN3601-農華106和‘DBN3608-農華106均是Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）雙基因抗蟲玉米，‘鄭單958和‘農華106是對照常規玉米。所有玉米品種均置于溫度為（26±1）℃的培養箱中培養。

1.2 供試蟲源

供試草地貪夜蛾種群于2019年1月19日采自云南省德宏州鮮食玉米田，共采集100余頭2～5齡幼蟲，在室內用玉米葉片飼養至化蛹，成蟲羽化后用10%的白糖水飼喂以補充營養和水分。成蟲產卵后收集卵塊，孵化后的幼蟲用基于黃豆面和玉米面配制的人工飼料飼養，飼養至不同齡期的幼蟲用于試驗。所有幼蟲和成蟲均置于溫度為（26±1）℃，濕度為60%±10%，光周期為L∥D=16 h∥8 h的培養箱中培養。

1.3 不同品種玉米葉片Cry1Ab和Vip3Aa蛋白表達量檢測

利用ELISA方法檢測玉米葉片中殺蟲蛋白含量。取V2-2葉期的玉米植株頂端第二片葉，每個品種以5片葉為1個生物學重復，共設3個生物學重復，每個生物學重復設3個技術重復。新鮮玉米葉片用液氮在研缽內迅速研磨成粉末，加入提取液PBST（pH為7.4、濃度為0.01 mol/L的PBS+0.55% Tween 20），置于搖床上4℃過夜;12 000 r/min離心15 min，取上清液，用提取液適量稀釋;將Cry1Ab和Vip3Aa標準品梯度稀釋，在96孔酶標板每孔加入50 μL enzyme-conjugate Cry1Ab或Vip3Aa后，分別加入50 μL樣品、陰性對照和標準品，用封口膜將酶標板封閉，輕搖混勻20～30 s，置于搖床上（200 r/min） 1～2 h;用力棄去液體后，每孔加入200 μL洗滌液，反復洗滌3次后用吸水紙吸干;每孔加入100 μL顯色底物，用封口膜將酶標板密封，外覆錫箔紙避光，輕搖混勻20～30 s，室溫放置15～30 min;每孔加入100 μL終止液終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測定OD值。

1.4 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對不同齡期草地貪夜蛾幼蟲的抗性測定

抗蟲性試驗在玉米播種后10 d左右進行，在玉米生長期內，不接觸其他任何殺蟲物質。將新鮮的玉米植株插入盛有約2 cm高2%瓊脂的玻璃指形管內（高12 cm，直徑3.3 cm），將不同齡期幼蟲接至玉米葉片上，1齡幼蟲每株幼苗接5頭，2齡、3齡和4齡幼蟲為避免自相殘殺對試驗結果的影響，每株幼苗接1頭，每個齡期50頭幼蟲為1個重復，設3個重復，共150頭幼蟲。指形管口用棉塞封閉防止幼蟲鉆出。然后置于溫度為（26±1）℃，濕度為60%±10%，光周期為L∥D=16 h∥8 h的培養箱內。5 d后檢查幼蟲死亡率，用毛筆輕觸蟲體，不能正常爬行者視為死亡，并稱取在不同玉米植株上存活下來的幼蟲個體體重，計算體重抑制率。

1.5 數據處理與分析

根據試驗數據，參照公式（1）和（2）計算各處理幼蟲的校正死亡率，參照公式（3）計算體重抑制率。

死亡率=處理后死亡試蟲數處理前供試總蟲數×100%（1）

校正死亡率=處理組死亡率-對照組死亡率1-對照組死亡率×100%（2）

體重抑制率=（對照組體重增加值-處理組體重增加值）對照組體重增加值×100%（3）

采用SAS 9.2統計分析軟件對所有數據進行方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種玉米葉片中Cry1Ab和Vip3Aa蛋白含量

2種Bt-Cry1Ab玉米、4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米以及2個對照常規玉米葉片中Cry1Ab、Vip3Aa及總蛋白含量見表1。ELISA檢測結果顯示，2種對照常規玉米的Cry1Ab含量均< LOQ，2種Bt-Cry1Ab玉米的Cry1Ab含量為75.55～87.75 μg/g，二者之間無顯著差異。而4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Cry1Ab含量為86.05～101.64 μg/g，不同品種間也無顯著差異，但除Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1（‘DBN3601-鄭單958）外，其他3種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Cry1Ab含量均顯著高于Bt-Cry1Ab玉米-2。2種Bt-Cry1Ab玉米與2個對照常規玉米的Vip3Aa含量均< LOQ，4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Vip3Aa含量為21.42～27.84 μg/g，彼此間無顯著差異。2種Bt-Cry1Ab玉米與2個對照常規玉米總蛋白含量無顯著差異，4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米中，Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2總蛋白含量最高，為（406.74±8.66） mg/g，顯著高于Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1，與其他2種無顯著差異。

2.2 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對不同齡期草地貪夜蛾幼蟲的抗性

2.2.1 不同齡期草地貪夜蛾幼蟲取食Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米后的死亡率

不同齡期草地貪夜蛾幼蟲取食Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米后的特征見圖1。

室內玉米葉片生測結果顯示：Bt-Cry1Ab玉米-1和Bt-Cry1Ab玉米-2飼喂的幼蟲其校正死亡率呈現出隨齡期增加而下降的趨勢。其中，1齡幼蟲的校正死亡率為59.23%～65.41%，2齡幼蟲的校正死亡率為40.80%～47.89%，對3、4齡幼蟲效果較差，校正死亡率僅為13.33%～34.14%。1、2、4齡幼蟲在2種Bt-Cry1Ab玉米上校正死亡率無顯著差異，3齡幼蟲在Bt-Cry1Ab玉米-2上的校正死亡率（34.14%±7.32%）顯著高于在Bt-Cry1Ab玉米-1上的校正死亡率（13.33%±0%）。

各齡幼蟲在4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上的校正死亡率均顯著高于在兩種Bt-Cry1Ab玉米上的校正死亡率，在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1、Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2、Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-3和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-4上，1、2齡幼蟲的校正死亡率均為100%±0%，3齡幼蟲的校正死亡率分別為86.67%±6.67%、84.44%±2.22%、95.12%±2.44%和95.12%±2.44%，1～3齡幼蟲在4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上的校正死亡率之間沒有顯著差異。4齡幼蟲的校正死亡率在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-4上最高，為77.27%±8.19%，顯著高于在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1上的校正死亡率53.02%±6.71%，后者與在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-3上的校正死亡率68.68%±2.24%和68.18%±6.01%無顯著差異（圖2）。

2.2.2 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對不同齡期草地貪夜蛾幼蟲體重的影響

用電子天平稱取處理前及處理后5 d各齡期幼蟲體重，因1齡幼蟲太小，無法稱取處理前及取食轉Bt玉米后的體重，所以，該部分只分析了2、3和4齡幼蟲體重。結果表明，轉基因玉米能顯著抑制幼蟲體重增加，取食轉基因玉米各齡期幼蟲的體重均顯著低于取食對照玉米的體重。Bt-Cry1Ab玉米-1和Bt-Cry1Ab玉米-2對2、3齡幼蟲的體重抑制率可達92.62%～107.97%，對4齡幼蟲的體重抑制率為59.50%～72.49%（表2）。在4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上，2齡幼蟲5 d后死亡率均為100%，故無法稱取處理后體重。4種Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對3齡幼蟲的體重抑制率為109.12%～122.22 %，對4齡幼蟲的體重抑制率為76.12%～92.43%。

3 討論

李國平等研究發現Cry1Ab、Cry1F、Vip3A和Cry2Ab蛋白對入侵草地貪夜蛾具有較強的致死作用，而Cry1Ac的效果較差，因此種植Cry1Ab、Cry1F或疊加的Cry1Ab（或Cry1F）+Vip3A、Cry1Ab（或Cry1F）+Cry2Ab玉米可控制草地貪夜蛾的發生與為害[17]。本研究結果顯示：取食Bt-Cry1Ab玉米，草地貪夜蛾幼蟲的校正死亡率為13.33%～65.41%，體重抑制率為59.50%～107.97%。如取食Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米，校正死亡率為53.02%～100%，體重抑制率為76.12%～122.22%。表明Bt-Cry1Ab玉米和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米對草地貪夜蛾1～4齡幼蟲均具有很好的防控效果，其中Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米的效果顯著優于Bt-Cry1Ab玉米，供試Bt玉米對1、2齡低齡幼蟲的防治效果均顯著優于對3、4齡高齡幼蟲的防治效果。

由于草地貪夜蛾的寄主作物較為廣泛，生產上需要將Bt玉米和化學農藥協同使用才能實現區域性防控的目標。趙勝園等的研究已表明，20%甲氰菊酯EC、15%唑蟲酰胺SC和25 g/L溴氰菊酯EC等對草地貪夜蛾卵具有較高的毒殺活性，1%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽EC、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽ME和75%乙酰甲胺磷SP等對草地貪夜蛾幼蟲具有較強的毒殺作用[9]。因此，在實際生產過程中，可基于各地作物種植結構和草地貪夜蛾的發生規律，進一步構建這些高效化學農藥和Bt玉米協同防控的技術體系。

雖然轉基因抗蟲玉米能夠有效控制草地貪夜蛾的為害，但是同化學殺蟲劑一樣，隨著Bt玉米的長時間、大規模種植，草地貪夜蛾在整個生長期就會持續處在Bt殺蟲蛋白的選擇高壓下，這樣就會逐漸演化出Bt抗性種群。波多黎各2003年開始商業化種植表達Cry1F的‘TC1507玉米，但2006年年底就發現草地貪夜蛾種群已對Cry1F玉米產生抗性[18]。2008年巴西首次引進Cry1Ab玉米（轉化體MON810），3年后發現草地貪夜蛾對其產生抗性，2009年引進Cry1F玉米，仍是3年時間便產生抗性，2010年引進Cry1A.105+Cry2Ab2玉米，到2013年在田間形成了抗性種群[19]。Huang等先后報道美國東南部草地貪夜蛾種群對Cry1F蛋白和Cry1A.105蛋白產生了抗性[2021]。2017年，Chandrasena等研究發現阿根廷草地貪夜蛾種群對Cry1F產生抗性[11]。

國際上雖然提出了多種抗性治理策略，但以高劑量庇護所和多基因策略的應用最為廣泛。在中國，采用“天然庇護所策略”有效延緩了棉鈴蟲對Bt棉花的抗性發展，利用“人工庇護所策略”有效延緩了紅鈴蟲對Bt棉花的抗性發展，從而實現了Bt-Cry1A棉花的可持續種植[22]，這為Bt玉米的種植提供了成功經驗。新殺蟲蛋白的研發也為Bt抗性治理提供更多的策略，如Bt營養期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，Vips），該蛋白是蘇云金芽胞桿菌在對數生長期分泌產生的，與在芽胞形成期產生的Cry晶體蛋白無交互抗性。表達Vip3Aa20蛋白的轉基因玉米已在美國、阿根廷和巴西等地商業化種植，該玉米可用于控制已對Cry殺蟲蛋白產生抗性的草地貪夜蛾種群。到目前為止，在美洲眾多商業化種植的Bt玉米中，草地貪夜蛾只對Vip3Aa20玉米仍然保持較高的敏感性，田間尚未發現該類玉米防治草地貪夜蛾失敗的現象[19]。

中國已有多家公司成功研發了Bt抗蟲玉米，我們對北京大北農生物技術有限公司研發的Bt-Cry1Ab（轉化體C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（轉化體DBN3601和DBN3608）抗蟲性的測定表明，中國已具備了研發和商業化種植轉基因抗蟲玉米的能力。鑒于草地貪夜蛾等鱗翅目害蟲為害的嚴重性，應盡快推動轉基因抗蟲玉米的商業化進程，要用先進的技術手段服務和支撐中國農作物生產的高質量發展。

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（責任編輯：楊明麗）