黏蟲CYP9A113基因的克隆及外源物質對基因表達的誘導效應

張雅男 劉月慶 JUNAID S M 王智琪 樊東

摘要 黏蟲是我國作物上最重要的害蟲之一。細胞色素P450能夠參與昆蟲外源物質代謝。本研究采用RACE技術克隆了一條編碼黏蟲P450基因的cDNA序列，并通過Real-time PCR技術，檢測了4種外源物質對該基因表達的誘導效應。該基因被國際P450命名委員會命名為CYP9A113，GenBank登錄號為KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD50處理黏蟲3 h，LD10、LD30和LD50處理12 h和24 h，可誘導表達CYP9A113基因;20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑的LD10處理黏蟲12、24和48 h，LD30和LD50處理24 h，CYP9A113基因表達呈誘導效應;0.1和0.5 mg/mL香豆素處理6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導效應;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇處理3、6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導效應。

關鍵詞 黏蟲; CYP9A113基因; 克隆; 外源物質; 誘導效應

中圖分類號： S 435.132

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018358

細胞色素P450酶（P450s或CYPs）是一類亞鐵血紅素硫醇鹽蛋白[1]，在哺乳動物的肝微粒體中首次被發現[2]，現已證明幾乎在所有生物體內廣泛存在。自1965年Ray在昆蟲體內發現P450后[3]，目前已經克隆得到分屬于CYP2、CYP3、CYP4和線粒體P450s的多個昆蟲細胞色素P450基因序列[4]，其中CYP3分支又包括CYP6和CYP9家族[5]，這些基因既能催化激素、信息素、脂肪酸等內源物質的合成，又能參與殺蟲劑、誘變劑、植物次生代謝物質等外源物質的代謝，對昆蟲的生長發育起著非常重要的作用[68]。采用98%氯氰菊酯（55 ng/μL）對野桑蠶Bombyx mandarina點滴1 μL處理后，脂肪體中CYP9A20和CYP9A21基因表達量均升高[9];甘藍夜蛾Mamestra brassicae經0.5 μL 2.5%溴氰菊酯水乳劑（0.152 ng/g）處理后，CYP9A90基因表達量總體呈誘導趨勢[10];甜菜夜蛾Spodoptera exigua經95%氯蟲苯甲酰胺（0.01 mg/kg和0.02 mg/kg）處理后，CYP9A9基因相對表達量升高[11];香豆素可誘導斜紋夜蛾Spodoptera litura脂肪體中CYP4M14和CYP6AB14基因的表達[1213]。吲哚-3-甲醇處理可誘導飛蝗Locusta migratoria體內CYP6HL1和CYP6FE12基因的表達[14]。

黏蟲Mythimna separata屬于鱗翅目，夜蛾科，是糧食作物上的重要害蟲之一[15]，在多個國家廣泛分布，我國除西藏地區未見報道外，其他各地均有報道[16]。本研究克隆黏蟲CYP9家族的一條P450基因，選取生產上常用于防治黏蟲的殺蟲劑2.5%高效氯氟氰菊酯乳油、20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑和黏蟲豆科寄主植物中含有的次生代謝物質香豆素[17]、十字花科蔬菜活性成分吲哚-3-甲醇[18]，對其進行誘導效應的研究，探究該基因在黏蟲外源物質解毒和對自然環境的適應性方面的重要作用，為利用分子手段防治該害蟲奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黏蟲M.separata采自東北農業大學向陽實驗基地，黑光燈誘集成蟲后于實驗室以5%的蜂蜜水飼養，幼蟲用玉米葉飼養，均放入恒溫培養箱中，溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%，光周期為L∥D=16 h∥8 h。在實驗室飼養2代后用作試驗材料。

1.2 供試試劑與藥劑

TRIzol Reagent試劑購自Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、低熔點瓊脂糖購于Promega公司;3′RACE試劑盒、5′RACE試劑盒、DNA純化試劑盒和Taq DNA聚合酶購于TaKaRa公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購于TOYOBO公司;2.5%高效氯氟氰菊酯乳油（EC）購于青島星牌作物科技有限公司，20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（SC）購于美國杜邦公司;香豆素（coumarin）和吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol）購于合肥博美生物科技有限公司;其余試劑為國產或進口的分析純。由上海生工生物有限公司完成基因的測序和引物合成。

1.3 CYP9A113基因序列的克隆及分析

1.3.1 總RNA的提取以及cDNA的合成

選擇健康的4齡黏蟲幼蟲為樣本，采用TRIzol提取法提取總RNA，按照反轉錄試劑盒的說明書合成cDNA，并保存于-20℃冰箱，剩余的RNA保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 全長基因序列的克隆

將GenBank上已經登錄的甘藍夜蛾M.brassicae CYP9A90（KR676343）和棉鈴蟲Helicoverpa armigera CYP9A12（AY371318）基因的序列進行比對，設計黏蟲保守區上下游特異性引物Ms9A-F和Ms9A-R（表1）。以1.3.1中合成的cDNA為模板進行PCR擴增，將得到的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，目的片段膠回收測序。根據3′RACE和5′RACE試劑盒中自帶的引物3′RACE-Ro、3′RACE-Ri和5′RACE-Ro、5′RACE-Ri，分別設計對應的嵌套引物Ms9A-3′RACE-Ro、Ms9A-3′RACE-Ri和Ms9A-5′RACE-Ro、Ms9A-5′RACE-Ri（表1）。按照試劑盒說明書，分別進行3′端序列和5′端序列的擴增，并進行膠回收測序。通過AlignX軟件將保守區序列、3′端序列和5′端序列進行拼接，得到完整的基因序列。再設計全長引物Ms9A-Full-F和Ms9A-Full-R（表1）克隆全長序列進行驗證，確定最終序列。

1.3.3 序列分析

該基因由國際P450命名委員會命名，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder （ORF Finder）將基因開放閱讀框翻譯成氨基酸序列;利用在線網站ExPASy （https：∥www.expasy.org/）進行功能域的預測;利用BioXM 2.6軟件進行蛋白質分子量和等電點的計算;利用MEGA 5.1軟件采用鄰接（neighbor-joining）法構建系統進化樹。

1.4 殺蟲劑的誘導效應

1.4.1 高效氯氟氰菊酯的誘導效應

選取4齡第1天黏蟲幼蟲，稱量單個蟲體的重量，計算平均值，將2.5%高效氯氟氰菊酯EC用丙酮稀釋成5個不同濃度，分別為33.33、16.67、8.33、4.17、2.08 μg/mL，以丙酮為對照。每個濃度藥劑和對照均點滴0.5 μL于蟲體的第2～3腹節之間，每處理20頭，3次重復，于培養箱中正常飼養條件培養。24 h后檢查死亡蟲數，求出2.5%高效氯氟氰菊酯EC對黏蟲的LD10、LD30和LD50。

選擇4齡第1天黏蟲幼蟲進行試驗，分別點滴0.5 μL LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC于黏蟲幼蟲2～3腹節之間，每處理和對照均點滴40頭，共設3個重復，放在實驗室飼養條件下培養，于3、6、12、24和48 h分別收集3頭存活的幼蟲，于液氮中速凍，放在-80℃冰箱中保存。每個重復的3頭幼蟲混合提取RNA后，根據熒光定量反轉錄試劑盒制備cDNA模板。采用SYBR Green染料3步法進行熒光定量，利用Primer 5.0軟件設計熒光定量上下游引物Ms9A-RT-F和Ms9A-RT-R（表1），以黏蟲β-actin作為內參基因，設計上下游引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。在熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX Connect）中進行反應，反應結束記錄熔解曲線和相關數據，檢測LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理不同時間CYP9A113基因的表達情況。

1.4.2 氯蟲苯甲酰胺的誘導效應

選擇4齡第1天黏蟲幼蟲進行試驗，饑餓處理12 h后利用ddH2O將20%氯蟲苯甲酰胺SC稀釋成5個不同濃度，分別為5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 μg/mL，以ddH2O為對照，每個濃度20頭黏蟲，3個重復。將玉米葉用打孔器打成直徑為1 cm的葉碟，其上點10 μL藥液晾干備用，每個培養皿中均放入1頭黏蟲和1片葉碟，葉碟吃光后用未處理正常葉片喂飼。24 h后檢查死亡蟲數，求出20%氯蟲苯甲酰胺SC對黏蟲幼蟲的LD10、LD30和LD50。

供試蟲體的選擇和試驗方法同上，分別用LD10、LD30和LD50進行處理，以ddH2O作為對照，每處理和對照均飼喂40頭，設3個重復，于3、6、12、24和48 h分別收集3頭存活的幼蟲，于液氮中速凍，放在-80℃冰箱中保存。提取RNA后，通過Real-time PCR檢測LD10、LD30和LD50的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理不同時間CYP9A113基因的表達情況，具體步驟參照1.4.1。

1.5 植物次生代謝物質的誘導效應

選取4齡第1天幼蟲進行試驗，香豆素和吲哚-3-甲醇均設兩個濃度，分別為0.1和0.5 mg/mL，用加熱的無菌ddH2O稀釋到所需濃度，對照為加熱的無菌ddH2O。待溶液溫度降到室溫時，開始試驗，之后的試驗方法均參照1.4.2。提取RNA后，通過Real-time PCR檢測不同濃度的2種植物次生代謝物質處理不同時間CYP9A113基因的表達情況，具體步驟參照1.4.1。

1.6 數據處理與分析

利用DPS軟件進行回歸統計分析;采用2-ΔΔCt法計算熒光定量PCR相對定量數據結果;數據的多重比較和差異顯著性分析利用SAS 9.4軟件Duncan氏檢驗法進行（P < 0.05）;數值均以平均值±標準誤（SE）表示;圖表的制作以及相關數據的計算均在Excel 2010中進行;將每一時間點CK均設為1，同一時間點進行差異顯著性分析作圖。

2 結果與分析

2.1 CYP9A113基因的鑒定及序列分析

通過克隆測序后拼接，進行序列全長的驗證后，得到一條包含1 752個堿基的P450基因序列，在NCBI上比對發現其屬于昆蟲CYP9A亞家族，經國際P450命名委員會命名為CYP9A113（GenBank登錄號：KY436739）。CYP9A113基因編碼529個氨基酸，分子量約為60.4 kDa，等電點為8.81。在編碼的氨基酸序列中，具有P450基因的保守序列，分別為血紅素結合域（FGVGPRNCIG）、meander結合域（PEKFDPERF）、螺旋C（WKDMR）、螺旋I（AGFETV）和螺旋K（ELLR）（圖1）。

翻譯后的氨基酸在NCBI的BLAST上比對，找出與之相似的其他鱗翅目昆蟲的氨基酸序列，進行系統進化樹的構建。結果發現，克隆的黏蟲M.separata CYP9A113（ARI68319）與甘藍夜蛾M.brassicae CYP9A13（AAR26518）、棉鈴蟲H.armigera CYP9A17（AAY21809）和美洲棉鈴蟲H.zea CYP9A12 （ABH09252）首先聚類，然后與斜紋夜蛾S.litura CYP9A39（ACV88722）和甜菜夜蛾S.exigua CYP9A9（BAG71410）聚類，再與草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda CYP9A58（AID55429）聚類，與六星燈蛾Zygaena filipendulae CYP9A36（ACZ97417）和家蠶Bombyx mori CYP9A19（BAM73827）等其他鱗翅目非夜蛾科昆蟲CYP9家族基因遺傳距離較遠，聚類結果基本符合形態分類特征（圖2）。

2.2 殺蟲劑對CYP9A113基因表達的誘導效應

2.2.1 高效氯氟氰菊酯對CYP9A113基因表達的誘導效應

經過室內毒力測定，2.5%高效氯氟氰菊酯EC對黏蟲4齡幼蟲的LD10、LD30和LD50分別為4.370 7（1.142 5～9.114 9）、18.771 4（8.957 0～28.947 1）和51.507 9（34.761 9～69.128 3）ng/g（表2）。

黏蟲幼蟲經LD10和LD30的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理3 h，CYP9A113基因表達均被抑制，經LD50處理3 h，CYP9A113基因相對表達量升高，呈現誘導效應;LD10、LD30和LD50處理6 h，CYP9A113基因表達均被抑制;LD10、LD30和LD50處理12 h，CYP9A113基因表達均呈誘導效應，相對表達量分別為對照組的2.5、2.0和2.1倍;LD10、LD30和LD50處理24 h，CYP9A113基因表達均呈誘導效應，相對表達量分別為對照組的2.6、1.9和2.3倍;LD10和LD50處理48 h，CYP9A113基因相對表達量無明顯變化，LD30處理下，CYP9A113基因表達被抑制（圖3）。結果說明，2.5%高效氯氟氰菊酯EC對CYP9A113基因表達產生誘導效應與時間和劑量有關。

2.2.2 氯蟲苯甲酰胺對CYP9A113基因表達的誘導效應

經過室內毒力測定，20%氯蟲苯甲酰胺SC對黏蟲4齡幼蟲的LD10、LD30和LD50分別為10.664 4（2.287 3～24.028 8）、49.980 0（21.438 3～80.395 8）和145.690 2（94.027 3～199.318 4）ng/g（表2）。

黏蟲幼蟲經LD10、LD30和LD50的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理3 h，CYP9A113基因相對表達量無明顯變化;3個劑量處理6 h，CYP9A113基因相對表達量均明顯降低;LD10處理12 h，CYP9A113基因表達呈誘導效應，為對照組的3.9倍，LD30和LD50處理下無明顯變化;LD10、LD30和LD50處理24 h，均對CYP9A113基因表達有誘導效應，分別為對照組的11.1、5.1和3.0倍;LD10處理48 h，CYP9A113基因表達呈誘導效應，為對照組的2.1倍，LD30和LD50處理下與對照相比無顯著差異（圖4）。

2.3 植物次生代謝物質對CYP9A113基因表達的誘導效應

黏蟲幼蟲經0.1和0.5 mg/mL香豆素處理3 h，CYP9A113基因表達均被抑制;處理6、12、24和48 h，均對CYP9A113基因的表達有誘導效應，且均在處理6 h誘導作用最強，分別為對照組的2.7和2.8倍;高濃度處理12、24和48 h，CYP9A113基因表達量均顯著高于低濃度處理（圖5）。結果說明，不同濃度香豆素處理6 h后，可能對CYP9A113基因表達均產生誘導效應，并且在12 h后，高濃度處理誘導效應高于低濃度處理。

黏蟲幼蟲經0.1和0.5 mg/mL的吲哚-3-甲醇處理3、6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導效應，低濃度處理48 h誘導作用最大，為對照組的2.0倍。高濃度處理12 h誘導作用最大，為對照組的2.4倍（圖6）。結果說明，不同濃度吲哚-3-甲醇處理不同時間，可能對CYP9A113基因表達均產生誘導效應。

3 結論與討論

細胞色素P450在合成具有關鍵生物學功能的內源物質和代謝天然或合成的外源化學物質方面起重要作用[6]，長期以來一直是研究的熱點。本研究克隆黏蟲的一條P450基因CYP9A113，屬于在異物代謝和殺蟲劑抗性中起重要作用的CYP9家族基因，研究了其在合成殺蟲劑和植物次生代謝物質誘導后的表達情況，結果發現外源物質對其有誘導效應，而且是在一定劑量下經過一定時間才產生，具有時間和劑量效應。

已有研究表明，家蠶B.mori經1 μL的98%氯氰菊酯（5 ng/μL）處理24 h，脂肪體中CYP9A22基因相對表達量升高[19]。飛蝗L.migratoria用3 μL溴氰菊酯（0.01、0.02、0.04、0.08和0.12 μg/mL）處理12 h，在3個較高濃度處理下CYP9AQ2基因表達量升高，存在劑量效應[20]。甜菜夜蛾S.exigua經0.01 mg/kg的95%氯蟲苯甲酰胺原藥處理36 h，CYP9A9基因表達誘導效應最高，0.02 mg/kg處理12 h誘導效應最高，存在時間和劑量效應[11]。不同藥劑對不同昆蟲的同一家族P450基因產生的效應也可能不同。在本研究中，黏蟲經LD10和LD30的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理12 h和24 h，對CYP9A113基因表達有誘導作用，LD50處理3、12和24 h均可產生誘導效應，說明基因的誘導反應與時間和劑量有關。LD50處理6 h，基因表達量降低，可能是由于蟲體特殊生理過程對其造成影響，3個劑量處理48 h均無誘導反應，可能因為細胞色素P450酶系的合成是個耗能過程，不會一直保持高含量，當需要時產生誘導作用，藥劑毒性逐漸消失，誘導作用也會慢慢消失。黏蟲經LD10的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理12、24和48 h，CYP9A113基因表達呈誘導效應，LD30和LD50處理24 h產生誘導效應，同樣具有時間和劑量效應，在開始的時間點沒有誘導效應產生，并且劑量高，產生誘導效應時間晚，可能是由于蟲體產生中毒反應，無法及時進行調節。

植物產生有毒物質防止被侵害，昆蟲體內物質也會相應調節進行解毒進而能夠取食植物，二者相輔相成，共同進化[12]。已有研究表明香豆素和吲哚-3-甲醇可對昆蟲P450基因產生誘導效應。吲哚-3-甲醇處理飛蝗L.migratoria 24 h，可誘導CYP6HL1和CYP6FE12基因的表達[14];斜紋夜蛾S.litura脂肪體中CYP4M14和CYP4S9基因表達均可被香豆素誘導[12]，并且用高濃度香豆素處理48 h，CYP6AB14基因在中腸和脂肪體中的表達量均高于低濃度處理時的表達量，表現出劑量效應[13]。本試驗將黏蟲用0.1和0.5 mg/mL香豆素處理3 h，基因表達無誘導效應，可能是因為其對蟲體產生較大刺激，未能及時做出反應。處理6、12、24和48 h，均有誘導效應，并且高濃度處理12、24和48 h基因相對表達量均顯著高于低濃度處理，與之前研究結果相似，存在時間和劑量效應。0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇處理每個時間點，基因表達均被誘導，說明可能在一定時間和劑量范圍內，吲哚-3-甲醇對CYP9A113基因表達均產生誘導效應。

本試驗克隆了黏蟲的一條P450基因CYP9A113，并對外源物質對該基因表達的誘導效應進行了研究，初步探索了CYP9A113基因的功能及其與外源物質的相互作用，為今后該基因的系統研究及其應用于黏蟲的防治提供基礎依據。

參考文獻

[1] NELSON D R， KAMATAKI T， WAXMAN D J， et al. The P450 superfamily： update on new sequences， gene mapping， accession numbers， early trivial names of enzymes and nomenclature[J]. DNA & Cell Biology， 1993， 12（1）： 151.

[2] ASPERGER O， KLEBER H P. Distribution and diversity of bacterial cytochromes P450 [C]∥RUCKPAUL K.Microbial and Plant Cytochrome P-450. London： Taylor and Francis， 1991： 153.

[3] RAY J W. The epoxidation of aldrin by housefly microsomes and its inhibition by carbon monoxide [J]. Biochemical Pharmacology， 1967， 16： 99107.

[4] FEYEREISEN R. Arthropod CYPomes illustrate the tempo and mode in P450 evolution [J]. Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics， 2011， 1814（1）： 1928.

[5] LI Xianchun， SCHULER M A， BERENBAUM M R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics [J]. Annual Review of Entomology，2007，52：231253.

[6] FEYEREISEN R. Insect P450 enzymes [J]. Annual Review of Entomology， 1999， 44： 507533.

[7] DING Tianbo， NIU Jinzhi， YANG Lihong， et al. Transcription profiling of two cytochrome P450 genes potentially involved in acaricide metabolism in citrus red mite Panonychus citri [J].Pesticide Biochemistry & Physiology，2013，106：2837.

[8] ANNE J， ANDERS M B G， LENE J R， et al. Biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine polychaetes [J]. Marine Environmental Research， 2008， 65（2）： 171186.

[9] 趙華強，宋麗莉，李兵，等.野桑蠶細胞色素P450氧化酶活性測定及CYP9家族基因的誘導轉錄[J].浙江農業學報，2010，22（3）：287291.

[10]劉月慶，樊星，周夏，等.甘藍夜蛾CYP9A90基因的克隆及溴氰菊酯對其誘導表達[J].植物保護，2017，43（1）：5460.

[11]王學貴，余慧靈，梁沛，等.氯蟲苯甲酰胺誘導甜菜夜蛾細胞色素P450基因上調表達[J].昆蟲學報，2012，58（3）：281287.

[12]王瑞龍，孫玉林，梁笑婷，等.6種植物次生物質對斜紋夜蛾解毒酶活性的影響[J].生態學報，2012，32（16）：51915198.

[13]WANG Ruilong， XIA Qingqing， BAERSON S R， et al. A novel cytochrome P450 CYP6AB14 gene in Spodoptera litura （Lepidoptera： Noctuidae） and its potential role in plant allelochemical detoxification[J]. Journal of Insect Physiology， 2015， 75： 5462.

[14]李亞紅.殺蟲劑及植物次生代謝物對飛蝗細胞色素P450基因的誘導表達[D].太原：山西大學，2015.

[15]江幸福，張蕾，程云霞，等.我國粘蟲研究現狀及發展趨勢[J].應用昆蟲學報，2014，51（4）：881889.

[16]張智.北方地區重大遷飛性害蟲的監測與種群動態分析[D].北京：中國農業科學院，2013.

[17]龔蕾，劉雁雨，焦必寧，等.植物中天然香豆素類化合物的提取純化技術研究進展[J].食品工業科技，2015，36（20）：377383.

[18]周穎，朱偉，楊杏芬.腫瘤化學預防劑吲哚-3-甲醇作用的靶點[J].熱帶醫學雜志，2007（8）：824827.

[19]趙華強，王東，李兵，等.家蠶細胞色素P450基因CYP9A22的克隆及在中腸和脂肪體的誘導轉錄[J].蠶業科學，2008，34（4）：634641.

[20]GUO Yanqiong， ZHANG Xueyao， WU Haihua， et al. Identification and functional analysis of a cytochrome P450 gene CYP9AQ2 involved in deltamethrin detoxification from Locusta migratoria [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2015， 122： 17.

（責任編輯：田 喆）