一株強致病力軟腐病菌鑒定與室內(nèi)藥劑篩選

李苗苗 伍翔 嚴準 吳中軍 高春生 劉新宇 程毅

摘要 通過對從湘西武陵山區(qū)感病蘿卜分離的一株軟腐病菌進行致病力測定，結(jié)合蘿卜軟腐病菌的培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)觀察、生理生化測定及6個看家基因（gapA， icdA， pgi， rpoS， mdh， proA）的多位點序列分析（MLSA），結(jié)果表明，病原細菌Secpp 1600屬革蘭氏陰性菌，呈桿狀，致病力強，可侵染分屬8科13個屬的多種經(jīng)濟作物;與迪基氏菌Dickeya fangzhongdai菌株高度同源。選用7種藥劑通過抑菌圈法對Secpp 1600進行了抑菌效果初步測定，結(jié)果表明，農(nóng)用鏈霉素、SPP3和SPP4 可抑制病菌生長，藥劑間抑菌率存在顯著差異，其中，SPP4的直接抑菌效果最好，最小抑制濃度為900 μg/mL。

關(guān)鍵詞 軟腐病菌; 看家基因; 迪基氏菌屬; MLSA; 最小抑菌濃度

中圖分類號： S 436.31

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018365

細菌性軟腐病菌主要來自于歐文氏菌屬Erwinia、果膠桿菌屬Pectobacterium 和迪基氏菌屬Dickeya，其中許多屬于強致病性軟腐細菌，Dickeya在國際上被列為十大植物病原細菌之一[1]，這些致病菌可導致多種作物及園藝產(chǎn)品軟腐病的發(fā)生，其中，Pectobacterium和Dickeya屬可以侵染50%的被子植物，寄主范圍非常廣泛，比如水稻、玉米、馬鈴薯、甘薯、番茄和蘿卜等[23]。當軟腐病菌不引起疾病時，可以作為內(nèi)生菌、附生菌和腐生菌生存，全世界農(nóng)業(yè)區(qū)的植物、土壤、新鮮地表水、地下水和昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)。軟腐病的發(fā)生和發(fā)展受環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，比如溫度、低氧等。

近年來，以蘿卜、白菜及結(jié)球甘藍等喜愛冷涼氣候的十字花科大宗蔬菜為主的高山蔬菜因其獨特的地理環(huán)境產(chǎn)地和優(yōu)良品質(zhì)而逐漸興起，可以彌補南方地區(qū)的“伏缺”，種植面積逐年增加。但是由于連年種植和結(jié)構(gòu)單一，導致近些年病害日趨嚴重，大大影響了高山蔬菜的產(chǎn)量及品質(zhì)[45]。其中，軟腐病對蘿卜的危害主要發(fā)生在根莖、葉柄及葉片，多發(fā)生在其生長后期及采后貯藏期;在生長期，一般從根尖發(fā)病蔓延至整個根部軟腐，呈爛泥狀，然后向上蔓延致葉片變黑褐色軟腐;蘿卜染病部位呈爛泥狀，發(fā)出難聞的惡臭。連種、雨水多、濕度大、根部開裂及地下害蟲等可加重軟腐病的發(fā)生。

本研究通過細菌形態(tài)觀察、致病力測定、生理生化鑒定結(jié)合MLSA-多位點序列分析鑒別了一株來自湘西高山地區(qū)的軟腐病致病菌，并對該病菌進行了室內(nèi)防治藥劑篩選，旨在為生產(chǎn)中蘿卜軟腐病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株Secpp 1600從湖南湘西武陵山區(qū)高山感病蘿卜分離得到。

供試藥劑：6%春雷霉素可濕性粉劑（上海立邦農(nóng)化有限公司），80%波爾多液可濕性粉劑（通州正大農(nóng)藥化工有限公司），72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑（山東百士威農(nóng)藥有限公司）和以噻唑鋅為主要有效成分的復配高效殺菌組合物SPP1～SPP4（北京圖為生物科技有限公司）。

1.2 病原菌回接與侵染試驗

基于柯赫氏法則，常溫無菌條件下將該菌株回接至蘿卜活體中，觀察發(fā)病特征。為進一步了解該菌株致病力大小與侵染范圍，將該菌株依次接入白菜Brassica pekinensis、結(jié)球甘藍B.oleracea、紫薯Ipomoea batatas、杏鮑菇Pleurotus eryngii、馬鈴薯Solanum tuberosum、蒜（地上及地下部分）Allium sativum、蔥A.fistulosum、冬瓜Benincasa hispida等分屬于8科13個屬的作物植株，約16 h后觀察癥狀并統(tǒng)計發(fā)病情況，軟腐病病情分級如下：0級，無病斑;1級，病斑占樣品體積1/4及以下;2級，病斑占樣品體積1/2及以下且大于1/4體積;3級，病斑占樣品體積3/4及以下且大于1/2體積;4級，病斑占樣品體積3/4以上，但是并未達到全部軟腐;5級，樣品全部軟腐[6]。

1.3 病原鑒定

1.3.1 菌體形態(tài)觀察及生理生化鑒定

將純化培養(yǎng)的菌株Secpp 1600劃線接種于LB培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)過夜，觀察并記錄菌株生長狀況及形態(tài)特征[7]。參照Suharjo等文獻進行革蘭氏染色、葡萄糖氧化發(fā)酵鑒定、在Kings B培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素的鑒定[8]、細菌氧化酶試驗[9]、酪蛋白水解[10]、硝酸還原反應(yīng)、過氧化氫酶、明膠液化、卵磷脂酶活性鑒定、硫化氫的產(chǎn)生、利用包含甲基綠和酚酞二磷酸酯的LB培養(yǎng)基鑒定致病菌磷酸酶活性[1112]、吲哚產(chǎn)生及MR-VP試驗，利用Ayers等基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒定28種含碳有機物是否可作為該菌株的碳源[13]，所有生理生化試驗至少設(shè)置3次重復，并設(shè)置對照試驗。

1.3.2 MLSA-多位點序列分析

從本課題組已獲得的Secpp 1600全基因組注釋信息以及NCBI數(shù)據(jù)庫中提取gapA， icdA， pgi， rpoS， mdh和proA 6個看家基因的序列信息[14]。通過BLASTn與GenBank中數(shù)據(jù)進行比對獲取同源序列，或者從ASAP數(shù)據(jù)庫獲取Dickeya， Erwinia和Pectobacterium 屬相關(guān)同源序列，用Mega X軟件進行多重比對，用Sequence Maxtrix 軟件聯(lián)合各位點序列[15]，再轉(zhuǎn)到Mega X中采用鄰接法（neighbor-joining method，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用iTOL在線工具制作進化樹[16]，根據(jù)多位點進化樹結(jié)果來分析Secpp 1600與同屬其他菌株及其他屬菌株的親緣關(guān)系，以確定分類地位。

1.4 不同藥劑對Secpp 1600的室內(nèi)防效測定

Secpp 1600于LB液體培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)過夜，按菌懸液與液體培養(yǎng)基1∶10（V∶V）的比例，將菌懸液加入到約30～40℃的LB固體培養(yǎng)基，制成含菌平板。

供試藥劑均設(shè)置為400倍、700倍和1 000倍3個濃度梯度，其質(zhì)量濃度分別約為2 500、1 500和1 000 μg/mL，以無菌去離子水處理作為對照，每個濃度均設(shè)置3次重復。

以抑菌圈法進行藥劑初選，用打孔器在新鮮的含菌平板上垂直、均勻地打出8個直徑0.5 cm的孔，分別注入約40 μL相同濃度的供試藥劑，加入等量的無菌水作為空白對照，34℃培養(yǎng)24 h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑菌率，并利用IBM SPSS 21進行了兩因素單變量的方差分析。

抑菌率=處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑處理抑菌圈直徑×100%

利用比濁法進行有效藥劑毒力測定，藥劑均設(shè)置至少5個梯度，以倍比法稀釋得到，按藥液與LB液體培養(yǎng)基1∶4 （V∶V）的比例將藥液加入培養(yǎng)基，并加入10 μL菌懸液，每個濃度梯度重復3次，設(shè)置陰性及陽性對照，37℃培養(yǎng)，當陽性對照OD600為0.5時，用酶標儀測所有處理吸光度，計算抑菌率，抑菌率接近1的最低濃度為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌形態(tài)觀察

Secpp 1600在LB固體培養(yǎng)基上34℃培養(yǎng)24 h，菌落多呈圓形，全緣，淡奶油色，中間突起，質(zhì)地均勻，表面光滑稍透明（圖1a），經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性細菌，呈桿狀（圖1b）。

2.2 侵染范圍與致病力測定

結(jié)果顯示，回接到蘿卜的Secpp 1600致病力明顯，受侵染的蘿卜全部軟腐甚至變軟流水（圖1c），與田間癥狀一致。通過觀察侵染其他蔬菜病癥及統(tǒng)計致病力，發(fā)現(xiàn)Secpp 1600不侵染紫薯、杏鮑菇;對其他的蔬菜侵染較明顯，能重度侵染蒜、蔥、白菜，對上述蔬菜具有強致病力（表1）。

2.3 生理生化指標分析

通過生理生化指標測定與分析，發(fā)現(xiàn)Secpp 1600能氧化發(fā)酵葡萄糖，在Kings B培養(yǎng)基上不能產(chǎn)生熒光色素，在硝酸還原、卵磷脂試驗、吲哚產(chǎn)生、MR-VP試驗、氧化酶活性和酪蛋白水解試驗中均表現(xiàn)為陽性。在硝酸還原試驗中，Secpp 1600直接還原NO3-到氮氣;Secpp 1600不能產(chǎn)生過氧化氫酶;Secpp 1600能利用D-（-）果糖、α-D-乳糖、D-（+）-棉籽糖等，不能利用D-（+）-海藻糖、D-（+）-松三糖、β-龍膽二糖等，能微弱地利用D-（+）-麥芽糖、糊精（表 2）。以上結(jié)果顯示，在重要的含碳有機物代謝的種間差異指標上，根據(jù)Samson等展示的結(jié)果，Secpp 1600與“Phenon1”的測定結(jié)果類似，該菌株能代謝β-龍膽二糖[3];根據(jù)Van der Wolf等展示的結(jié)果，該菌株與D.solani和D.dadantii subsp. dadantii結(jié)果類似[17];根據(jù)Parkinson等展示的結(jié)果，該菌株與D.dadantii subsp. dadantii NCPPB 898T的結(jié)果類似[18]，不同的是Secpp 1600能水解酪蛋白;根據(jù)胡白石等展示的結(jié)果，該菌株與D.dadantii subsp. dadantii NCPPB898、 D.fangzhongdai、D.solani NCPPB4479T和D.zeae NCPPB3531特征類似，不同之處在于β-龍膽二糖代謝和酪蛋白的水解[19]。因此，根據(jù)以上結(jié)果可以初步明確Secpp 1600屬于Dickeya屬，但是由于含碳有機物代謝上的差異還不足以確定其種名。

2.4 MLSA-多位點序列分析

通過BLASTn比對，從GenBank中獲取Secpp 1600、D.dadantii DSM 18020、D.dadantii 3937、D.zeae Ech586等菌種的同源基因同源序列，部分序列號如表3所示，從ASAP數(shù)據(jù)庫獲取其他菌株部分相關(guān)序列如表3所示。

通過6個看家基因gapA， icdA， pgi， proS， mdh和proA聯(lián)合系統(tǒng)進化樹結(jié)果分析（圖2），Dickeya、Erwinia和Pectobacterium屬的菌株分別以較高的Bootstrap value聚在不同分支，說明同屬的菌株親緣關(guān)系較近。Dickeya sp.Secpp 1600和D.fangzhongdai DSM 101947聚類在親緣關(guān)系最近的一個分支，Bootstrap value達100，序列同源性較高，兩個菌株親緣關(guān)系較近，與生理生化結(jié)果基本統(tǒng)一。

2.5 殺菌劑的室內(nèi)防效測定

預(yù)篩選藥效試驗表明，春雷霉素、波爾多液、SPP1和SPP2對病原菌沒有抑菌作用;農(nóng)用鏈霉素、SPP3和SPP4可抑制病菌生長，其中農(nóng)用鏈霉素與SPP4抑菌效果較好，與SPP3藥劑抑菌效果差異顯著（P<0.05）;在這3種藥劑處理中，不同梯度間抑菌效果無顯著差異（表4）;抑菌圈效果如圖3所示。

選取農(nóng)用鏈霉素、SPP3及SPP4通過比濁法進行了最小抑制濃度（MIC）測定。結(jié)果顯示（表5），MIC分別為1 080、1 800和900 μg/mL，SPP4 MIC最低，毒力最強，其次為農(nóng)用鏈霉素，最后為SPP3。

3 結(jié)論與討論

Dickeya是由Samson等于2005年對 “E.chrysanthemi complex”重新分類成立的新屬[3]，其中一些菌種的分類地位一直在修訂，新種也在不斷加入。Brady、Van der Wolf、Parkinson等先后利用生理生化鑒定方法、DNA雜交、16S rDNA序列比對、多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析和核苷酸一致性分析等鑒定方法豐富了D.dadantii、D.solani、D.aquatica等菌種[1718，20]。胡白石等利用以上類似方法及脂肪酸分析等成立了包含3個菌株的D.fangzhongdai新種[19]。當前Dickeya屬主要包括D.dadantii， D.chrysanthemi， D.solani和D.zeae等8個種[21]。微生物分類的動態(tài)發(fā)展大大促進了高度同源的Dickeya屬菌種鑒定方法體系的形成，以上研究為軟腐病菌的鑒別、鑒定提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。但是該種種水平的分類仍然存在一定的爭議。

對Secpp 1600進行生理生化鑒定的結(jié)果表明，Secpp 1600與D.dadantii、D.fangzhongdai， D.solani和D.zeae菌株特征非常類似，主要差異在于β-龍膽二糖代謝和酪蛋白的水解。從多序列比對的結(jié)果來看其聚類在Dickeya屬，與 D.fangzhongdai、D.solani和D.dadantii關(guān)系最近。

當前，化學防治仍為細菌性病害防治的主要手段，銅制劑和抗生素為代表性藥劑。目前抑菌效果顯著的農(nóng)用鏈霉素因禁用現(xiàn)已退市，隨著軟腐病情的加劇及病菌抗性增強，新藥開發(fā)及篩選迫在眉睫;而且對于突發(fā)性病害，化學防治手段十分必要[22]。本研究為了篩選Dickeya sp. Secpp 1600防治藥劑，選用了傳統(tǒng)藥劑及新藥共7種藥劑進行室內(nèi)防效測定，結(jié)果顯示春雷霉素、波爾多液、SPP1和SPP2對該病原菌無直接抑制作用，農(nóng)用鏈霉素、SPP3和SPP4可直接抑制該病菌的生長。SPP4的最小抑制濃度遠小于農(nóng)用鏈霉素，也表明其有替代農(nóng)用鏈霉素和進一步開發(fā)的潛力。通過回接到蘿卜及對其他蔬菜的致病力檢測，該菌株能嚴重侵染多種經(jīng)濟作物，易感寄主主要為十字花科和百合科蔬菜，因此，該菌株具有潛在的危害多種經(jīng)濟作物的能力，應(yīng)重視對該病害的預(yù)防，防治上要有側(cè)重和策略，作物輪作應(yīng)避開易感作物，并及時清潔田園。

參考文獻

[1] MANSFIELD J， GENNIN S， MAGORI S， et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology， 2012， 13（6）：614629.

[2] MA B， HIBBING M E， KIM H， et al. Host range and molecular phylogenies of the soft rot enterobacterial genera Pectobacterium and Dickeya[J]. Phytopathology， 2007， 97（9）：11501163.

[3] SAMSON R， LEGENDRE J B， CHRISTEN R， et al. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi （Burkholder et al. 1953） Brenner et al. 1973 and Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrysanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineation of four novel species， Dickeya dadantii sp. nov.， Dickeya dianthicola sp. nov.， Dickeya dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2005， 55（4）：14151427.

[4] 邱正明，郭鳳領(lǐng)，聶啟軍，等.我國高山蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展對策[J].長江蔬菜，2006（11）：14.

[5] 別之龍.高山蔬菜發(fā)展的背景和可持續(xù)發(fā)展的建議[J].長江蔬菜，2006（11）：56.

[6] 王文峰，張秀玲，司東霞，等.鉀對大白菜軟腐病發(fā)生及保護酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45（33）：3941.

[7] 鄒婧澤，嚴準，程毅，等.三個蘿卜主產(chǎn)區(qū)軟腐病病原菌的分離與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2016，55（23）：61306133.

[8] KING E O， WARD M K， RANEY D E， et al. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin[J]. Translational Research， 1954， 44（2）：301307.

[9] KOVACS N. Identification of pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction [J]. Nature， 1956， 178（4535）：703.

[10]MOSCA C O， MORAGUES M D， LLOVO J， et al. Casein agar： A useful medium for differentiating Candida dubliniensis from Candida albicans [J].Journal of Clinical Microbiology， 2003， 41（3）：12591262.

[11]SATTA G， GRAZI G， VARALDO P E， et al. Detection of bacterial phosphatase activity by means of an original and simple test [J].Journal of Clinical Pathology，1979，32（4）：391395.

[12]FALGUNI P， SHARMA M C. Study on microbial alkaline phosphatase production from north gujarat field soils [J]. International Journal of Institutional Pharmaceutical Sciences， 2014， 4：8391.

[13]RADIX S， SAWADA H， TAKIKAWA Y. Phylogenetic study of japanese Dickeya spp. and development of new rapid identification methods using PCR-RFLP[J]. Journal of General Plant Pathology， 2014， 80（3）：237254.

[14]晉知文， 宋加偉， 謝學文， 等. 芹菜細菌性軟腐病病原的分離與鑒定[J]. 植物病理學報， 2016， 46（3）：304312.

[15]VAIDYA G， LOHMAN D J， MEIER R. SequenceMatrix： concatenation software for the fast assembly of multi-gene datasets with character set and codon information [J]. Cladistics， 2011， 27（2）：171180.

[16]LETUNIC I， BORK P. Interactive tree of life （iTOL） v3： an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees [J].Nucleic Acids Research，2016，44（W1）：242245.

[17]VAN DER WOLF J M， NIJHUIS E H， KOWALEWSKA M J， et al. Dickeya solani sp. nov.， a pectinolytic plant-pathogenic bacterium isolated from potato （Solanum tuberosum） [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2014， 64（PART 3）：768774.

[18]PARKINSON N， DEVOS P， PIRHONEN M， et al. Dickeya aquatica sp. nov.， isolated from waterways [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2014，64（PART 7）：22642266.

[19]TIAN Yanli， ZHAO Yuqiang， YUN Xiaoli， et al. Dickeya fangzhongdai sp. nov.， a plant-pathogenic bacterium isolated from pear trees （Pyrus pyrifolia） [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2016，66：28312835.

[20]BRADY C L， CLEENWERCK L， DENMAN S， et al. Proposal to reclassify Brenneria quercina （Hildebrand and Schroth 1967） Hauben et al.1999 into a new genus， Lonsdalea gen. nov.， as Lonsdalea quercina comb. nov.， descriptions of Lonsdalea quercina subsp. quercina comb. nov.， Lonsdalea quercina subsp. iberica subsp. nov. and Lonsdalea quercina subsp. britannica subsp. nov.， emendation of the description of the genus Brenneria， reclassification of Dickeya dieffenbachiae as Dickeya dadantii subsp. dieffenbachiae comb. nov.， and emendation of the description of Dickeya dadantii[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2012， 62（7）：15921602.

[21]馮潔. 植物病原細菌分類最新進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2017， 50（12）：23052314.

[22]晉知文， 謝學文， 馬墨， 等. 蔬菜細菌性軟腐病防治藥劑活體組織篩選技術(shù)[J]. 植物保護學報， 2017， 44（2）：269275.

（責任編輯：田 喆）