美人蕉黃斑駁病毒巢式PCR檢測方法的建立

陳細紅 楊小龍 廖富榮 高芳鑾 沈建國

摘要 本文以我國臺灣進境美人蕉病株為材料，根據已報道的美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）基因序列設計2對特異性引物（外側引物1對、內側引物1對），建立了巢式PCR快速檢測CaYMV的方法，并對進境的50份美人蕉樣品進行了檢測。結果顯示，該方法特異性強，且靈敏度高于常規PCR，是常規PCR的1 000倍，表明該方法能夠實現對CaYMV的快速、準確、靈敏檢測，適用于口岸快速檢測CaYMV。

關鍵詞 美人蕉黃斑駁病毒; 巢式PCR; 檢測

中圖分類號： Q 503， S 41-30

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018283

美人蕉Canna indica L.是美人蕉科Cannaceae美人蕉屬Canna的一種多年生草本花卉，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，具有一定的觀賞價值和藥用價值，在我國常作為一種園林觀賞植物進行引種栽培[14]。美人蕉在生長過程中易受病毒侵染，國內外關于美人蕉病毒病的研究較少，目前已報道的美人蕉病毒有菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus（BYMV）[5]、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、美人蕉矮化類病毒Canna stunt viroid[67]、美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）[8]、美人蕉黃條病毒Canna yellow streak virus（CaYSV）[9]等。

美人蕉黃斑駁病毒（CaYMV）是美人蕉上的一種重要病毒，屬于花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae桿狀DNA病毒屬Badnavirus成員。其病毒粒體呈桿狀，長約120～130 nm，直徑約28 nm[10]，基因組為不完全環狀雙鏈DNA，含3個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。該病毒最早出現在日本和美國中北部[1113]，隨后在意大利、荷蘭[14]、印度[2]、肯尼亞[15]、中國[16]等國家陸續出現報道。CaYMV的寄主范圍較窄，已報道的自然寄主為美人蕉。受侵染的美人蕉生長出現異常，典型癥狀為葉脈黃化，葉片、莖稈和花上出現條斑，組織逐漸壞死、變褐等，其觀賞價值和經濟價值均受到影響[1011]。CaYMV主要通過無性繁殖材料傳播，可隨美人蕉種苗的運輸進行遠距離傳播，其傳播介體尚未明確，且目前尚缺乏有效的防治該病的方法。

為有效降低CaYMV的傳播和擴散，急需建立針對該病毒快速、靈敏的檢測方法。國內外針對CaYMV檢測方法的研究較少，沈建國等[10]報道了常規PCR檢測該病毒的方法。與常規PCR相比，巢式PCR方法檢測植物病毒具有更強的特異性和更高的靈敏度。張巧萍等[17]設計了鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物，建立了巢式PCR檢測方法，提高了檢測的靈敏度。聞偉剛等[18]通過建立煙草環斑病毒和番茄環斑病毒的半巢式RT-PCR檢測方法，靈敏度較常規RT-PCR方法提高了10 000倍以上。本文以我國臺灣進境美人蕉病株為材料，根據已報道的CaYMV基因序列設計了2對特異性引物（外側引物1對、內側引物1對），建立了巢式PCR快速檢測CaYMV的方法，以期進一步提高檢測靈敏度和準確性，以滿足口岸快速、準確檢測CaYMV的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

CaYMV毒源為我國臺灣進境的美人蕉病株。菜豆黃花葉病毒（BYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）以及番茄不孕病毒Tomato aspermy virus（TAV）的毒源（葉片）由本實驗室保存。所有毒源均保存于-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

Plant Genomic DNA kit購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Easy Taq PCR Supermix、TRIzol試劑購自北京全式金生物技術有限公司，隨機引物、5×RT buffer、M-MuLV 反轉錄酶、RNasin、10 mmol/L dNTPs 購自Promega 公司，10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、MgCl2、Taq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司。

1.3 引物設計與合成

桿狀DNA病毒屬通用引物BadnaFP/BadnaRP：ATGCCITTYGGIAARAAYGCICC/CCAYTTRC-AIACISCICCCCAICC，目的片段576 bp[19]。

根據已報道的CaYMV基因序列設計2對特異性引物，外側引物為：上游引物CaYMVF1：5′-TAG-GGCAGTCAAGGATTAAGC-3′;下游引物CaYMVR1：5′-CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3′，預期擴增片段大小為540 bp。內側引物為：上游引物CaYMVF2：5′-ACTGCGTCAGTTTCTCGG-3′;下游引物CaYMVR2：5′-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3′，預期擴增片段大小352 bp。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 總核酸的提取

利用Plant Genomic DNA kit提取樣品總DNA，方法參照試劑盒說明書。

1.5 PCR鑒定

以提取的DNA為模板，PCR反應體系（25 μL）為：2×Easy Taq PCR Supermix 12.5 μL，無菌水8.5 μL，BadnaFP（10 μmol/L）1 μL，BadnaRP（10 μmol/L）1 μL，DNA 2 μL。擴增條件為：94℃預變性7 min;94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環;最后72℃延伸7 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 巢式PCR檢測

第一輪PCR以提取的DNA為模板，PCR反應體系（25 μL）為：10×PCR Buffer （Mg2+free） 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF1（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR1（10 μmol/L）1 μL，無菌水13.8 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA 2 μL。擴增條件為：94℃預變性3 min;94℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環;最后72℃延伸10 min。第二輪PCR擴增以第一輪PCR產物為模板，反應體系為：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF2（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR2（10 μmol/L）1 μL，無菌水15.6 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，第一輪PCR產物0.2 μL。擴增條件為：94℃預變性3 min;94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 序列測定及分析

PCR產物經回收純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測得的核苷酸序列在NCBI中運用BLAST程序進行同源性比較分析。

1.8 巢式PCR的特異性驗證

菜豆黃花葉病毒（BYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、番茄不孕病毒（TAV）提取總RNA后，反轉錄為cDNA，同攜帶CaYMV的樣品DNA一起進行巢式PCR擴增，同時以健康美人蕉植株的DNA為模板設陰性對照，以無菌水為模板設空白對照，反應體系及擴增條件同1.6。

1.9 巢式PCR的靈敏度測定

將CaYMV的DNA原液進行10倍梯度稀釋，分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9不同稀釋度的DNA為模板，利用建立的巢式PCR方法進行擴增，同時設陰性對照，測定其靈敏度。

1.10 樣品檢測

利用建立的巢式PCR方法對口岸送檢的一批美人蕉樣品（共50份）進行檢測。檢測方法同1.4～1.7。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定

以提取的DNA為模板，以引物BadnaFP/BadnaRP進行擴增，結果從美人蕉病株中擴增出與預期大小一致的條帶，約576 bp，而空白對照和陰性對照均未擴增出相應的特異性條帶（圖1）。將所得的目的片段進行克隆和測序，測得的序列進行BLAST比對，與已報道的CaYMV序列一致性達97%以上，證實樣品攜帶有CaYMV。

2.2 巢式PCR檢測

以第一輪PCR產物為模板，利用設計的內側引物進行第二輪PCR，結果從帶毒樣品中擴增出與預期大小一致的條帶，約352 bp，而空白對照和陰性對照均未擴增出相應的特異性條帶（圖2）。將所得的目的片段進行克隆和測序，測得的序列進行BLAST比對，與已報道的CaYMV序列（GenBank登錄號：KT447042）一致性達99%。

2.3 巢式PCR的特異性驗證

分別以BYMV、CMV、TAV的cDNA以及攜帶CaYMV的樣品DNA為模板，在相同條件下進行巢式PCR，同時設陰性對照，結果從圖3可見，僅攜帶CaYMV的樣品在352 bp處出現明亮的DNA條帶，其他病毒樣品和健康樣品均無條帶，表明建立的巢式PCR方法具有較強的特異性。

2.4 巢式PCR的靈敏度測定結果

將攜帶CaYMV樣品的DNA按10倍梯度稀釋后，分別作為模板，單獨使用CaYMVF1/CaYMVR1進行擴增，在1～3泳道均能擴增出540 bp的單一條帶（圖4a），而使用CaYMVF2/R2進行第二輪PCR擴增，在泳道1～6均能擴增出352 bp的條帶（圖4b）。第二輪PCR的檢測靈敏度比第一輪PCR高103倍，即巢式PCR使檢測靈敏度提高了103倍，由此表明，該病毒的巢式PCR的靈敏度明顯高于常規PCR，前者的靈敏度是后者的103倍。

2.5 樣品檢測

檢測結果表明，采用巢式PCR法能夠從50份美人蕉樣品中檢測出CaYMV 9份（檢出率為18%），比常規PCR檢出率（8%）高10個百分點，表明本文建立的巢式PCR方法具有更高的靈敏度。

3 討論

美人蕉黃斑駁病毒（CaYMV）是美人蕉上發生率較高的病毒之一，在美國、日本等美人蕉大面積種植的地區發生較為普遍，導致美人蕉的觀賞價值和經濟價值下降。目前尚未有針對CaYMV有效的防治方法，在美國曾被迫采取銷毀病株的方式來防止其進一步擴散，給當地帶來較大的經濟損失[10]。因此，加強病毒檢測，建立針對CaYMV快速、準確的檢測方法，對有效防止該病毒隨帶病植株的遠距離運輸而擴散，保護我國觀賞作物的生產安全意義重大。本文根據已報道的CaYMV序列設計了內、外側2對特異性引物，在常規PCR的基礎上，建立了可用于CaYMV快速檢測的巢式PCR方法。

本文建立的巢式PCR方法僅能夠從感染CaYMV的樣品中擴增到特異性目的片段，而從其他病毒樣品及健康樣品中均未擴增到相應的目的片段，提高了PCR擴增的特異性，有效避免了非目的片段的擴增。與常規PCR相比，本文建立的巢式PCR方法經過2輪PCR反應，檢測靈敏度得到顯著提高，使整個PCR檢測靈敏度提高了1 000倍（第一輪、第二輪的檢測下限分別為10-2和10-5倍稀釋的DNA）。應用本文建立的巢式PCR方法對進境的美人蕉樣品進行CaYMV檢測，檢出率為18%，明顯高于常規PCR的檢出率，因此當CaYMV含量較低時，該方法能彌補常規PCR方法可能存在的漏檢問題，使檢測結果更為準確可靠。本文建立的巢式PCR檢測CaYMV的方法具有快速、簡便、特異和靈敏的優點，能夠有效應用于CaYMV檢測。

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（責任編輯：田 喆）