云南主栽核桃品種對Alternaria alternata葉枯病的抗病性評價

賀占雪 馬建鵬 楊斌 趙寧

摘要 為了解云南地區不同核桃品種對葉枯病的抗性，從而為核桃抗病品種選育和葉枯病的防治提供依據，試驗采用田間調查和離體葉片接種法獲得病斑面積和病情指數，采用聚類分析的方法對田間調查和離體接種的病斑面積進行聚類分析，并結合病害分級標準，綜合評價云南主栽37個核桃品種對Alternaria alternata的抗病性。結果表明：‘大泡核桃1葉片上未出現病斑，‘小圓果病斑面積最小， 為5.05 mm2，而‘圓菠蘿2病斑面積最大，達到887.68 mm2;采用Ward最小偏差平方和法和歐式距離進行聚類分析，其聚類效果與接種結果和田間調查結果的吻合度最好。通過田間調查和離體接種綜合評價，將37個核桃品種分為13個抗病品種、15個中抗品種、7個中感品種和2個感病品種。

關鍵詞 核桃; 葉枯病; Alternaria alternata; 抗性評價

中圖分類號： S 436.6

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018345

云南核桃栽培范圍廣、面積大、產量產值高，是云南林業產業的重要組成部分。云南全省核桃種植面積達288萬hm2，其中約有67萬hm2掛果，年核桃干果產量達100多萬t，產值超過380億元，是云南省林業產業中產值最高、效益最好、農民得益最多的產業[12]。隨著人工栽培面積的擴大，加之高效管理技術不到位，病蟲害發生也逐漸增加。據云南省林業有害生物防治檢疫局統計，截至2013年底，全省核桃病蟲害發生面積1.3萬hm2，其中蟲害發生面積0.7萬hm2、病害發生面積0.6萬hm2;2016年全國森林有害生物普查，發現云南核桃病蟲害發生面積已經超過7萬hm2，其中病害發生4.7萬hm2，這顯示核桃病蟲害發展速度十分迅猛。核桃葉枯病是由Alternaria alternata引起的核桃葉部常見病害，是核桃產業發展中面臨的一個重要病害。該病害會降低核桃的結實量和果實飽滿度，給當地核桃生產和農民的經濟收入帶來損失，嚴重制約核桃產業的發展。

鏈格孢屬真菌是引起植物葉枯病的主要病原菌[35]，1999年Belisario等首次報道了由Alternaria alternata引起的核桃葉斑病[6]，2004年Belisario等再次報道了引起榛子和核桃葉枯病的病原是A. alternata[7]，2006年Hong等報道了A. alternata是引起歐榛和核桃葉枯病的病原[8]，2010年徐陽等報道了新疆南疆和田墨玉縣托乎拉鄉的核桃葉枯病是由A. alternata引起[9]，2012年曲文文等明確危害核桃的鏈格孢菌是A. alternata[10]，2015年韓敏從新疆喀什地區分離到核桃葉枯病病原A. alternata[11]。項目組前期對云南省核桃病害研究時發現A. alternata同樣是引起核桃葉枯病的主要病原。

應用抗病品種是防治植物病害最經濟安全的方法，而抗病性鑒定和抗病種質資源的篩選是品種合理利用和抗病育種工作的基礎[12]。余仲東等[13]采用針刺接種法對核桃枝條進行接種試驗評價了12個核桃品種對Botryosphaeria引起的潰瘍病的抗性;牛亞勝等[14]采用標準差法研究了20個核桃品種對黑腐病的抗病性，石進昌等[15]采用田間試驗法對核桃細菌性黑斑病進行了抗性調查，篩選出抗性較高的品種。筆者對云南主栽的37個核桃品種對葉枯病病原Alternaria alternata抗性進行了初步測定和評估，以期對核桃品種的引種栽培提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：供試鏈格孢Alternaria alternata由西南林業大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室分離并保存。

接種材料：接種用核桃樹葉片采自大理白族自治州林業科學研究所核桃種質資源圃不同品種的嫩葉。每一供試品種選取生長良好、樹勢相對一致的核桃樹，采集樹冠外圍中部健壯的發育枝中部復葉，采摘第3～4片小葉，葉寬4～5 cm，長10～12 cm。種質資源圃于2010年建成，所采集的37個核桃的品種信息如表1。

1.2 方法

1.2.1 田間調查

2017年、2018年于核桃葉部病害發病初期、盛發期和盛發后期，在云南大理、楚雄、昌寧、臨滄等地的核桃種植基地進行核桃葉枯病田間自然發病調查。每個品種選取具有代表性的10株，每株分別從東西南北4個方向各選擇10片葉，調查葉枯病病葉的生長狀況、病斑面積、病斑形狀、大小、顏色、數量等，采用十字交叉法測量病斑直徑，統計相關數據，計算相應的病斑面積均值和病情指數。

病情指數=∑（病級×該級葉片數）總葉片數×最高病級×100。

病害分級標準參照苜蓿匍柄霉葉斑病的分級標準，稍有改進[16]。

以病情指數為基礎，采用相對抗病性評價不同品種的抗性程度，根據病情指數并參照王瑜等[17]抗性分級研究中劃分標準進行抗性劃分。抗病：病情指數<5;中抗：5≤病情指數≤15;中感：15<病情指數≤25;感病：病情指數>25。

1.2.2 離體接種

1.2.2.1 菌株培育及接種材料處理

鏈格孢在PDA培養基上于25℃培養5 d后，采用3 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，備用。

供試核桃嫩葉用75%乙醇表面消毒后用無菌水沖洗3次，吸干表面水分，用石英砂在葉片正面固定部位摩擦，造成輕微傷口，備用。

1.2.2.2 接種

試驗采集的37個核桃品種的葉片大小相近。在培養皿底層放入濾紙并加入無菌水使其潤濕，將經過處理的葉片放入培養皿內，葉柄基部用浸濕的脫脂棉裹住以保持水分;然后將制好的菌餅反扣在葉片摩擦部位，以接種無菌PDA為對照，各處理重復10次。每天觀察記錄接種后葉片的發病情況。3 d后開始按十字交叉法測量病斑直徑，直至第7天，采用第5天的數據計算病斑面積。

病害分級標準參照黃德芬[18]的分級標準，在此基礎上進行改進。將接種后葉片出現的病斑面積分為以下幾級（表3）。

1.2.3 數據處理與分析

所收集的試驗數據進行病情指數計算，再用SPSS 22.0軟件進行聚類分析。根據所測量的直徑計算出病斑面積，然后去掉病斑面積數據的最大值和最小值，依次進行以下6種處理：不轉換、對數轉換、平方根轉換、中心化轉換、規格化轉換以及標準化轉換;聚類方法采用組間連接法、組內連接法、最近距離法、最遠距離法、重心法、中位數法、Ward最小偏差平方和法等7種方法;聚類距離采用歐氏距離。將數據處理方法、聚類方法和聚類距離分別組合進行數據分析，依據接種后的平均病斑面積和聚類分析結果，篩選出最適合的聚類分析方法。

1.3 抗性評價

根據田間調查和離體接種的結果進行系統聚類分析，結合病情指數分級，對37個核桃品種對Alternaria alternata的抗性進行劃分。

2 結果與分析

2.1 田間調查抗性評價

由表4可以看出，37個核桃品種的病情指數在2.5～32.6范圍內。病情指數是反映不同核桃品種抗病性的一項重要指標，根據病情指數劃分37個核桃品種的抗病性：抗病品種13個，占35.13%;中抗品種16個，占43.24%;中感品種6個，占16.22%;感病品種2個，占5.40%。

按病斑面積均值，對37個品種進行系統聚類分析，結果顯示，將各重復病斑平均面積原始數值不作轉換、聚類方法采用Ward最小偏差平方和法、聚類距離采用歐式距離，所得聚類結果與田間調查病情指數劃分結果吻合度最好，符合田間調查病斑大小的分布規律。據此，以歐式距離5作為聚類分割點，將37個核桃品種分為4類，第1類13個抗病品種;第2類16個中抗品種;第3類6個中感品種;第4類2個感病品種（圖1）。

2.2 離體鑒定抗性評價

將鏈格孢接種在37個核桃品種葉片上，測量病斑直徑，計算5 d后病斑面積，按照病害分級標準，將37個核桃品種分為4類抗性等級：第1類有16個抗病品種，病斑面積在0～40.14 mm2范圍內;第2類有12個中抗品種，病斑面積在52.48～124.96 mm2范圍內;第3類有7個中感品種，病斑面積在174.76～327.44 mm2范圍內;第4類有2個感病品種，病斑面積大于840 mm2（表5）。

用離體接種葉片的病斑面積進行聚類分析，將37個核桃品種分為4類，第1類16個抗病品種占43.24%;第2類12個中抗品種占32.43%;第3類7個中感品種占18.91%;第4類2個感病品種占540%（圖2）。

2.3 田間調查與離體接種抗病性綜合評價

表6結果顯示，兩種方法的抗病性評價結果吻合度較高，有33個品種對Alternaria alternata的抗性結果一致，占測試品種的89.2%。綜合評價后，將測試的37個品種對Alternaria alternata抗性分為4類。第1類13個抗病品種（R）：‘大泡核桃1、‘小圓果、‘三臺核桃1、‘夾棉小麻、‘紙皮核桃、‘圓菠蘿1、‘大泡核桃4、‘新新2號、‘漾雜一號、‘大泡核桃3、‘夾棉大麻、‘桐子果、‘小胖若核桃;第2類15個中抗品種（MR）：‘新翠豐、‘云新云林1、‘小泡核桃、‘方殼核桃、‘云新云林2、‘大泡核桃2、‘漾雜三號、‘青皮大泡、‘云新90303、‘四方果、‘大木瓜核桃、‘三臺核桃2、‘大包殼、‘漾雜二號、‘娘青核桃;第3類7個中感品種（MS）：‘云新高原、‘云新90306、‘漾江一號、‘細皮核桃、‘大尖嘴、‘新早豐、‘扎343;第4類2個感病品種（S）：‘云新90301、‘圓菠蘿2。

3 結論與討論

抗病性評價是植物病害防治的重要途徑，是作物抗病育種的重要基礎，從抗原篩選、后代選擇、直到品種推廣的全過程都離不開抗病性評價。抗性是寄主、病原物和環境三者之間相互作用的綜合表現，抗病或感病是相對于特定的菌株和特定環境條件下品種的表現型[1922]。而聚類分析法是多種植物抗性評價方法之一，作為數據分析工具，聚類的結果滿足相同組中數據對象的差距盡可能的小，不同組中的數據差距盡可能大的鑒定方法，在各個領域都得到廣泛的應用[2325]。在本次試驗研究中使用聚類分析法，可以將試驗樣品在抗病性方面的數量性狀按其性質的親疏度進行分類，從而得出不同品種的抗性分級。試驗過程中采用SPSS 23.0軟件對室內離體接種后的葉片病斑面積進行聚類分析，將37個核桃品種分為抗病、中抗、中感、感病4類，并且試驗結果與田間調查的抗病性評價結果高度吻合。陳永芳等應用關聯分析法，對橘類18個品種和其果實品質進行了綜合評價，明確了最優品種，試驗結果證實了聚類分析可以作為選擇優良品種的評價方法[26]。

核桃葉枯病是一種較大程度影響核桃產業可持續發展的植物病害，目前主要采用化學防治，不僅污染環境，還容易產生抗藥性，選育和栽培抗病品種成為生產中防治該病安全而長效的方法。本研究采用田間調查和離體接種方法評價了云南主栽的37個核桃品種對A.alternata引起的葉枯病的抗性，離體接種的結果與田間調查的結果吻合度較高，經過綜合評價將37個核桃品種對葉枯病的抗性反應劃分為抗病、中抗、中感、感病4個類別，其中13個品種抗病，15個品種中抗，7個品種中度感病，2個品種感病。這種方法適合于人工接種條件下核桃品種對葉枯病的抗病反應分類。本研究結果顯示，同一核桃品種不同樹齡表現出了對葉枯病的不同抗性，在相同的環境因子下，隨著樹勢增強，抗性也相應增強。本研究為今后核桃種植過程中篩選抗病基因，選育新的抗病種質資源，進一步優化抗病育種和葉枯病的防治等方面提供了基礎數據，并為今后核桃新品種培育和核桃產業的健康發展提供了科學依據。

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（責任編輯：楊明麗）