山茶灰斑病病原菌鑒定及防治藥劑初步篩選

張曉勇 李樹江 王亮 楊友聯

摘要 為明確引起貴州六盤水山茶灰斑病的致病菌種類和防治方法，用單孢分離法獲得3株菌株。通過形態學觀察和rDNA-ITS、β-tubulin、tef1多基因序列進行分析，確定該病原菌為葡萄牙擬盤多毛孢Pestalotiopsis portugalica。6種常規殺菌劑室內藥效測定結果表明，50%多菌靈可濕性粉劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種苯并咪唑類殺菌劑在推薦濃度范圍內對P.portugalica的抑制率達到了100%，75%百菌清可濕性粉劑在推薦濃度范圍內對該病原菌的抑制率也在90%以上;有效成分濃度為250～500 mg/L的70%代森錳鋅可濕性粉劑和75～300 mg/L的75%百菌清可濕性粉劑可顯著促進P.portugalica產孢。

關鍵詞 山茶; 擬盤多毛孢; 灰斑病; 形態特征; 多基因序列分析; 殺菌劑

中圖分類號： S 436.8

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018331

山茶Camellia japonica L.是集觀賞和藥用于一身的經濟價值較高的中國傳統園林花木。山茶輪紋病（ring-rot disease）、炭疽病（anthracnose）、枯梢病（shoot blight）和灰斑病（gray leaf spot）等是山茶栽培中最常見的幾種病害[1]，常導致較大的經濟損失。其中山茶灰斑病最為常見，葉部病斑多發生于葉緣，呈不規則形，灰褐色至灰白色，邊緣暗褐色，病健交界明顯，孢子堆（分生孢子盤）黑色，呈球狀或卵圓狀，病害嚴重時導致大量葉片枯萎，嫩枝表皮縱裂，嚴重影響山茶的生長。前人研究發現，山茶灰斑病主要由擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis Steyaert真菌引起，已報道的病原有污斑擬盤多毛孢P.maculans （Corda） Nag Raj[2]、白珠樹擬盤多毛孢P.gaultheriae Dearn. & House[3]、長剛毛擬盤多毛孢P.longiseta （Speg.） K. Dai & Tak. Kobay[4]、山茶擬盤多毛孢P.camelliae Yan M. Zhang， Maharachch. & K.D.Hyde[5]和葡萄牙擬盤多毛孢P.portugalica Maharachch.， K. D.Hyde & Crous[6]。

本研究于2014年8月在貴州六盤水市一苗圃場采集到有明顯灰斑病癥狀的山茶葉片，經挑取病斑內的呈黑色小顆粒狀的孢子堆鏡檢，發現其分生孢子和分生孢子盤具有顯著的擬盤多毛孢屬真菌特征。為準確鑒定采集分離的病原菌種類，采用形態學ITS（內轉錄間隔區Internal transcribed spacer）、β-tubulin（β-微管蛋白）、tef1（翻譯延伸因子Translation elongation factor 1）等基因的序列分析相結合的方法，對病原菌進行鑒定，并進行室內殺菌劑藥效測定，旨在為山茶灰斑病的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

采用單孢分離法對病原菌進行分離和純化[7]，獲得3株菌株（編號為LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）。菌株在PDA斜面上培養7～10 d后置于4℃保存。

1.2 病原物形態學鑒定

1.2.1 菌株活化與生長速率測定

將4℃條件下保存的3個菌株轉接至2% PDA（新鮮馬鈴薯20 g煮汁過濾后加入2 g蔗糖，15 g瓊脂，用水定容至1 000 mL）平板，于25℃恒溫培養7 d后以5 mm直徑打孔器從菌落邊緣打取菌塊，接入另一PDA平板中央，5個重復，25℃下黑暗培養7 d，測量菌落直徑，觀察菌落特征。

1.2.2 產孢細胞及分生孢子的誘導

將4～6根經雙重滅菌的松針置于SNA培養基（KH2PO4 0.2 g，KCl 0.2 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 蔗糖0.4 g，瓊脂15 g，用水定容至1 000 mL）平板表面誘導其產生分生孢子[8]。待松針上有黑褐色孢子堆形成后在體視鏡下挑取孢子堆制片，用正置顯微鏡（Olympus BX51）拍攝產孢細胞和分生孢子的顯微結構，并測量大小。

1.3 病原菌的分子鑒定

1.3.1 病原菌DNA提取

將供試菌株分別接種于PDA平板上，置于25℃恒溫培養7 d后刮取菌絲，用改良的CTAB法提取DNA[9]。

1.3.2 基因組DNA檢測

取2 μL總基因組DNA樣品進行電泳檢測 （1.2%瓊脂糖凝膠、0.5×TAE電泳緩沖液，5 V/cm電壓）。

1.3.3 目的基因的擴增與序列測定

擴增的目的序列分別為ITS、β-tubulin和tef1三個基因片段。ITS基因選用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）;β-tubulin基因選用引物BT2A（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）;tef1基因選用引物EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATA-CCACCRATCTT-3′）[10]。PCR擴增反應體系（25 μL）：正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板2 μL。擴增ITS的PCR 反應條件：94℃預變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環;最后72℃延伸5 min。擴增β-tubulin的PCR 反應條件：95℃預變性4 min;94℃變性48 s，55℃退火48 s，72℃延伸60 s，35個循環;72℃延伸5 min擴增tef1的PCR 反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性18 s，54℃退火33 s，72℃延伸30 s，35個循環;最后72℃延伸7 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由成都柏輝生物科技有限公司進行純化和測序。

1.3.4 序列分析

將本試驗分離的3個菌株所測得的ITS、β-tubulin和tef1序列與從GenBank中下載的33個模式菌株或公認菌株對應的基因序列（表1）用Clustalx 2.0軟件進行比對，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株號：MFLUCC 120652）為外類群，以Paup*4.0 beta 10軟件以最大簡約法（maximum parsimony， MP）進行分析，以啟發式搜索法（heuristic search）構建系統發育樹，分析供試菌株的分類地位[11]。

1.4 殺菌劑對病原菌室內藥效測定

采用含藥PDA平板測定殺菌劑藥效[12]。參照商品農藥推薦使用濃度范圍，6種殺菌劑及其有效成分濃度梯度分別設置為：50%多菌靈可濕性粉劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑75、150、300、600、1 200 mg/L;75%百菌清可濕性粉劑75、150、300、600、1 200 mg/L;70%代森錳鋅可濕性粉劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L;15%三唑酮可濕性粉劑50、100、150、200、250 mg/L和37%苯醚甲環唑水分散粒劑5、15、25、50、100 mg/L。在60℃的PDA培養基中分別添加相應質量的商品制劑，混合后制成含藥平板，以添加無菌水為對照組，每個處理3個重復。以5 mm直徑打孔器打取活化的純培養物接種到含藥平板，在25℃下避光培養7 d后用十字交叉法測定各平板上菌落直徑，并計算抑菌率[13]，若產生孢子堆，則計算分生孢子堆密度。數據運用DPS v 7.05以LSD法進行單因素方差分析。

抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-5 mm）×100%;

分生孢子堆密度（個/mm2）=孢子堆數量/菌落面積。

2 結果與分析

2.1 山茶灰斑病的發病癥狀

如圖1所示，在山茶葉片上，葉部病斑近圓形或不規則形，多從葉片邊緣開始形成并逐漸擴大，初期水漬狀，呈黑褐色，病健交界明顯，后期病斑部位擴大并逐漸干枯呈灰色，葉表皮組織易脫落，嚴重者形成缺刻或穿孔。病斑內形成球狀隆起的小黑點，分布稀疏，直徑300～1 500 μm不等。葉部病斑小黑點部位橫切面可見分生孢子盤，孢子盤上可清晰看到產孢細胞和未脫落的分生孢子，分生孢子（15～20）μm×（5～6）μm，呈梭形，具有4個隔，5個細胞，中部細胞顏色呈深棕色，頂端有附屬絲1～3條，具有顯著的擬盤多毛孢屬真菌特征。

2.2 山茶灰斑病病原菌的形態學鑒定

山茶灰斑病分離菌株形態學特征如圖2所示。3株菌株在2%PDA培養基上培養7 d后，菌落平均直徑均為（7.65±0.23）cm（n=5），生長速度為（10.92±0.35）mm/d。培養物菌落呈同心環狀，疏松，絨毛狀，未產分生孢子堆，菌落背面淡黃色（圖2a），初步鑒定3株菌株屬于同一個種。

在SNA培養基中的松針上所形成的孢子堆呈黑褐色球形，直徑200～500 μm，為半流動狀的黑色黏液團，其基部嵌入松針表皮生長（圖2b）。在顯微鏡下，其分生孢子梗倒棍棒狀，有隔，透明，基部1～2個不規則分支，長短不一。產孢細胞簇生，呈球形、圓柱形或安瓿瓶狀，長度8.0～20.0 μm （±SD=13.52 μm±3.68 μm，n=15），透明，寬2.2～4.6 μm（±SD=2.99 μm±0.75 μm，n=15）（圖2c～d）。分生孢子紡錘形，直，偶稍有彎曲，4個隔將分生孢子分為5個細胞，分生孢子大小為（16.3～22.5）μm×（4.4～7.1）μm （±SD=（20.5±2.1）μm×（5.4±0.7）μm， n=30）;基部細胞倒圓錐狀，與中部細胞之間接觸平截面較小，長度2.5～5.4 μm （±SD=4.3 μm±0.6 μm， n=30），透明，薄壁。中間3個細胞呈甕狀至近圓柱形，厚壁且有小疣突，長度10.2～17.3 μm （±SD=12.5 μm±1.6 μm， n=30），隔處略微縊縮，3個細胞顏色相同，淺棕黃色至深棕黑色，隔膜較周圍細胞顏色更深，其中第2個細胞長2.9～5.8 μm （±SD=4.4 μm±0.7 μm， n=30），第3個細胞長3.5～5.9 μm （±SD=4.2 μm±0.5 μm， n=30），第4個細胞長3.3～5.6 μm （±SD=3.9 μm±0.6 μm， n=30）。頂部細胞圓錐狀，隔膜處顯著收縮，細胞壁較薄、光滑，細胞呈透明狀，長度2.8～5.3 μm （±SD=1.7 μm±0.6 μm， n=30）。頂部細胞頂部具1～3根管狀附屬絲，透明，尖端絲狀，附屬絲從頂部細胞的頂部共點分支或從主附屬絲上多回分支，長度10～25 μm （±SD=15.3 μm±3.9 μm， n=30）。基部附屬絲（中生柄）無或1條，透明，管狀，長度1～4 μm （±SD=2.4 μm±1.5 μm， n=30），分生孢子基部中生（圖2e～l）。

通過對代表性菌株的進一步培養和顯微形態觀察，并與該屬已知種相比較，將所分離的3株菌株初步鑒定為Pestalotiopsis portugalica Maharachch.， K. D.Hyde & Crous[6，8]。

2.3 病原菌多基因分子系統學分析

將本試驗分離的3株菌株所測得的ITS、β-tubulin和tef1序列與從GenBank中下載的33個模式菌株或公認菌株對應的基因序列用ClustalX 2.0進行比對，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株號：MFLUCC 12-0652）為外類群，并以Heuristiv Search構建的系統發育樹如圖3所示。在該樹中，本研究分離的3個菌株（LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）都與P.portugalica模式菌株及其他菌株聚為一支，支持率為100%，支持了形態學鑒定結果。

2.4 菌株對不同殺菌劑的敏感性

如表2所示，與對照相比，所有處理下菌株LPSU 2014023的菌落直徑都顯著減小，其中50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP的4個高濃度（有效成分，下同）和其他4種殺菌劑的最高濃度處理直接導致接種的菌餅上的菌絲死亡，抑菌率100%。當75%百菌清WP濃度降低至75 mg/L，70%代森錳鋅WP濃度降至125 mg/L，15%三唑酮WP濃度降至150 mg/L和37%苯醚甲環唑WG濃度降至25 mg/L時對病原菌抑制率降低至85%以下，防效顯著降低。說明在推薦濃度范圍內，50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP對該病原菌的抑制效果最佳，而70%代森錳鋅WP、15%三唑酮WP和37%苯醚甲環唑WG在推薦濃度范圍內抑菌效果相對較差。此外，從表2中還可以看出，濃度為250～500 mg/L的70%代森錳鋅WP和75～300 mg/L的75%百菌清WP可顯著促進培養物產孢。

3 討論

擬盤多毛孢屬真菌廣泛分布于自然界，屬寄生性較弱的半知菌。傳統上對擬盤多毛孢屬真菌進行分類以分生孢子大小、中間3個細胞的顏色和長度、附屬絲長度和形狀等形態特征作為依據，并將擬盤多毛孢屬真菌分為三大類有顯著區別的進化群，第一個類群分生孢子的中間3個細胞呈顏色均勻的淺棕色或橄欖色，第二個類群為顏色均勻的暗黑色，第三個類群為雜色[14]，本文報道的3菌株即屬于第三個類群。但隨后多基因序列分析證明以顏色來進行分類是不可靠的[10]，而且這些形態特征與菌株培養環境有關。山茶灰斑病主要由擬盤多毛孢屬真菌引起，已報道的擬盤多毛孢屬病原有污斑擬盤多毛孢[2]、白珠樹擬盤多毛孢[3]、長剛毛擬盤多毛孢[4]、山茶擬盤多毛孢[5] 和葡萄牙擬盤多毛孢[6]。本文采用傳統形態學特征，結合ITS、β-tubulin和 tef1多基因序列分析確定山茶灰斑病的病原菌為葡萄牙擬盤多毛孢P.portugalica。

目前已知的葡萄牙擬盤多毛孢全部分離自山茶屬植物[15]，該真菌模式菌株（CBS393.48）最早于1948年采自葡萄牙，后由Maharachchikumbura等對其進行系統的分類研究[6]。在分類學上，其近緣種有P.camelliae，P. furcata和P.novae-hollandiae，P.portugalica與3個近緣種的分生孢子結構相似，且頂端附屬絲數量較少，不過3個近緣種的分生孢子大小分別為（23～34）μm×（5.5～9.0）μm[5，8]、（29～39）μm×（8.5～10.5）μm[16]和（25～32）μm×（8～10）μm[6]，與P.portugalica的分生孢子大小有明顯的區別。Liu等[8]從采集自江西省廬山植物園的山茶上分離到該種（菌株號：LC4360和LC0670）。本研究首次在我國西南地區從山茶灰斑病病斑上分離到葡萄牙擬盤多毛孢。

多菌靈和甲基硫菌靈都屬于苯丙咪唑類殺菌劑，其作用機理都是抑制真菌細胞β-微管蛋白合成，阻礙正常有絲分裂[17]。從本研究試驗結果來看，在推薦濃度范圍內，苯丙咪唑類殺菌劑對菌株LPSU 2014023的抑制效果最佳，這與前人獲得的藥劑對擬盤多毛孢屬病原菌室內抑菌效果一致[1819]。但苯丙咪唑類殺菌劑在人畜安全性上一直被人們所詬病，而且作用位點單一，病原菌極易產生抗性[20]，Omatsu等研究表明分離自日本鹿兒島市茶葉種植區的P.longiseta菌株已對苯丙咪唑類殺菌劑產生抗性[21]。百菌清可破壞真菌細胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD）活性，使真菌細胞糖代謝受損[22]。在該試驗中百菌清在推薦濃度范圍內對所分離的病原菌表現出較好的抑制效果。代森錳鋅可抑制真菌細胞丙酮酸的氧化，且錳和鋅元素可促進植物生長及提高抗性，多位點保護，不易產生抗藥性[23]，本試驗表明70%代森錳鋅WP在1 000 mg/L以上才能達到100%的抑制效果，而在250～500 mg/L濃度下會促進所分離的病原菌產孢，增強其對不良環境的抵抗能力。三唑酮和苯醚甲環唑都是真菌甾醇生物合成抑制劑[24]，可導致真菌細胞裂解死亡，本研究表明，在推薦濃度范圍內這兩種甾醇合成抑制劑抑菌效果并不理想。鑒于此，建議在擬盤多毛孢屬真菌引起的病害防治中，應多種殺菌劑混合使用或交替使用，以提高防治效果和避免產生抗藥性。

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（責任編輯：楊明麗）