一株產木聚糖酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

王月琳 吳玉婷 石玉

摘要 從土壤中篩選出一株高產木聚糖酶的菌株ZK2，結合形態學以及16S rDNA 序列同源性分析對菌株進行鑒定，并對菌株的產酶條件進行優化。結果表明，菌株與枯草芽孢桿菌的相似度最高，在溫度38 ℃、初始pH 8.0、發酵時間54 h、接種量10%時，菌株的產酶條件最優。

關鍵詞 木聚糖酶；枯草芽孢桿菌；篩選；發酵條件

中圖分類號 Q814.1 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）08-0168-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.044

Abstract A strain ZK2 with producing xylanase ability was isolated from the soil in Wuhan，Hubei Province.Strain ZK2 was identified based on physiological and sequence homology analysis of 16S rDNA sequence.Single factor experiments such as temperature，initial pH，fermentation period，inoculum size，were preliminarily optimized.The results showed that the strain had high similarity to the sequence of Bacillus subtilis.The optimum conditions for xylanase production were as follows：the optimal fermentation temperature of 38 ℃，initial pH of 8.0，fermentation period of 54 h，inoculum size of 10%.

Key words Xylanase；Bacillus subtilis；Screening；Fermentation conditions

木聚糖（xylan）為多聚五碳糖，是主要存在于植物細胞壁中的半纖維素成分，也是除纖維素外自然界中含量最豐富的可再生多糖[1-2]。木聚糖雖然廣泛存在于植物體內，但動物基本不能消化吸收。木聚糖酶（DxylanxylanohydrolaseEC3.2.1.8）是一類木聚糖降解酶系，屬于水解酶類[3]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協同完成，其中木聚糖酶（β-1，4-D-xylanase）是最關鍵的水解酶，以內切方式作用于木聚糖主鏈內部的 β-1，4-木糖苷鍵，其主要水解產物為低聚木糖和少量木糖[4]，為木聚糖的進一步應用起著極為重要的作用。

木聚糖酶具有重要的應用價值，在飼料[5]、造紙[6]、食品和醫藥[2-3]等行業均有廣泛的應用。因此，對木聚糖酶的開發研究具有極大的商業價值。木聚糖酶主要來源于真菌、細菌、藻類和原生動物[7-9]，當前絕大多數商用木聚糖酶來源于真菌，主要由于真菌的產酶量相對較高。但真菌發酵周期長，且大部分真菌木聚糖酶最適作用條件偏于中性，使其在造紙、飼料、食品等工業極端環境下應用受到一定限制[10]，而細菌木聚糖酶在耐極端條件方面有較強的優勢[10-13]，因此，從自然界中篩選細菌源的木聚糖酶仍具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 土樣采自湖北省武漢市湯遜湖旁。酵母浸粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硝酸銨，均為分析純，購自國藥集團有限公司，木聚糖購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，瓊脂購于Biosharp，Japan。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、JY600 DNA電泳儀、HH-S6 恒溫水浴鍋、OHG-914385-III電熱恒溫鼓風干燥箱、TG16-WS 臺式高速離心機、 SW-CJ-ZG超凈工作臺、Bio-rad MyCycler PCR儀、Spx-250b-d全溫振蕩培養箱、722型紫外可見分光光度計。

1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏0.50%、蛋白胨1.00%、氯化鈉0.50%、pH 7。

選擇培養基：櫸樹木聚糖0.50%、硝酸銨0.30%、酵母浸粉0.40%、氯化鈉0.50%、磷酸氫二鉀0.20%、硫酸鎂0.02%、瓊脂2.00%、pH 7。發酵培養基：玉米芯粉3.00%、蛋白胨0.50%、磷酸氫二鉀0.50%、pH 7。

1.3 產木聚糖酶菌株的分離與篩選

取100 mL蒸餾水加入裝有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，高壓滅菌，將1 g土樣加入錐形瓶中，振蕩30 min，按 10 倍稀釋法進行稀釋，取土樣稀釋液10-4、10-5、10-6的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基的平皿中，30 ℃培養48 h。挑取單菌落，用牙簽點樣至選擇培養基，并做好標記；于30 ℃培養48 h。培養后，用0.2%的剛果紅染色20 min，用蒸餾水洗去染液，再用1 mol/L氯化鈉洗脫10 min，觀察有無透明圈，測量透明圈的直徑D及菌斑的直徑d，并計算D/d，挑選比值最大的菌株做后續研究。

1.4 產木聚糖酶菌株的鑒定

1.4.1 形態學鑒定。觀察菌株的菌落特征，并挑取少許菌體做細胞染色，觀察其形態特征。

1.4.2 菌株的16S rDNA 序列分析。

采用細菌通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ ）和1492R（5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）[14]擴增分離株的16S rDNA。PCR反應條件：首先預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測后回收，送至上海桑尼生物科技有限公司測序，序列通過NCBI的Blastn比對分析，并利用軟件Mega 4構建系統進化樹。

1.5 木聚糖酶活力的測定

1.5.1 木聚糖酶液的制備。

將菌株接種于發酵培養基，培養適當時間后，取適量于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液，即為粗酶液[15]。

1.5.2 木糖標準曲線制作。

配制1.0 μmol/mL的木糖標準溶液，分別取標準木糖溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL， 去離子水補足至2 mL，再加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，立即放冷水中冷卻，定容至10 mL，用分光光度計測定 540 nm下的吸收值。以木糖含量為橫坐標，OD540為縱坐標，繪制木糖標準曲線。

1.5.3 木聚糖酶活性的測定。

1.9 mL含1%木聚糖的底物，加入0.1 mL 適當稀釋的酶液，30 ℃準確反應10 min后加入2 mL DNS溶液終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加水定容至10 mL，充分搖勻，以滅活酶液做對照，測量樣品540 nm波長處的吸光度。

木聚糖酶活力的定義： 30 ℃條件下，1 mL粗酶液1 min水解木聚糖生成1 μmol還原糖（木糖）的酶量，稱為1個酶活力單位，U/mL。

1.6 產木聚糖酶菌株的產酶條件優化

1.6.1 溫度對酶活的影響。將菌株接種至發酵培養基中，初始pH 7、接種量為10%，溫度分別為22、26、30、34、38、42 ℃，培養48 h，提取粗酶液，測定處理液的酶活。

1.6.2 初始pH對酶活的影響。

將菌株接種至發酵培養基中，溫度為30 ℃，接種量為10%，pH分別為4、5、6、7、8、9，培養48 h，提取粗酶液，測定處理液的酶活。

1.6.3 發酵周期對酶活的影響。

將菌株接種至發酵培養基中，溫度為30 ℃，接種量為10%，pH 7，發酵時間分別為18、30、42、54、66、78 h，提取粗酶液，測定處理液的酶活。

1.6.4 接種量對酶活的影響。將菌株接種至發酵培養基中，溫度為30 ℃，pH 7，接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%、25%，培養48 h，提取粗酶液，測定處理液的酶活。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

經過平板篩選，挑取能產生透明圈的菌株2株。由表1可知，菌株ZK2的產木聚糖酶活性較ZK5高，因此選取ZK2做后續試驗。

2.2 菌株ZK2的形態學鑒定與分子生物學鑒定

2.2.1 菌株ZK2的形態鑒定。菌株ZK2 的菌落為白色、圓形，邊緣光滑，菌落不透明。鏡檢發現菌體桿狀，革蘭氏染色為陽性，產芽孢（圖1）。

2.2.2 菌株ZK2 16S rDNA的鑒定。以菌株ZK2基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA的通用引物進行PCR擴增，得到1.5 kb左右大小的條帶（圖2）。

16S rDNA比對結果表明，ZK2與枯草芽孢桿菌的相似性最高。從系統發育樹看，ZK2與枯草芽孢桿菌聚為一簇，結合形態學、 16S rDNA序列分析，將菌株ZK2鑒定為枯草芽孢桿菌（圖3）。

2.3 菌株ZK2產酶條件的優化

2.3.1 木糖標準曲線的制作。按“1.5.2”制作木糖標準曲線，結果見圖4。

2.3.2 培養溫度對酶活的影響。

由圖5可知，產木聚糖酶的發酵培養最適溫度為38 ℃，在該溫度下發酵培養液產酶能力最好。在培養溫度22～38 ℃時，酶活力隨溫度的升高而增加，溫度高于38 ℃時，產酶能力開始下降。

2.3.3 初始pH對酶活的影響。由圖6可知，產木聚糖酶的發酵初始培養 pH為 8.0 時，產酶能力最強，說明菌株ZK2最適宜在堿性環境下產木聚糖酶。

2.3.4 發酵周期對酶活的影響。

由圖7可知，在發酵時間為18～54 h時，產酶能力逐漸增加，發酵時間為54 h時，產酶能力最強，菌株ZK2產木聚糖酶的最適發酵培養時間為54 h。

2.3.5 接種量對酶活的影響。

由圖8可知，當接種量為15%時，產木聚糖酶菌株的產酶活力最高，接種量為0～15%時，酶活逐漸增加，當接種量大于15%后，酶活漸漸降低。由于接種量較大時，菌體生長過快，導致發酵液的黏度增加，在供氧量不變的情況下，會造成溶氧量不足而影響木聚糖酶的生成，因此最適接種量為10%。

3 結論與討論

通過稀釋涂平板，用透明圈法檢測酶活的大小，從土壤中篩選出一株高產木聚糖酶菌株ZK2。對ZK2進行形態學鑒定以及分子生物學鑒定，通過16S rDNA比對，ZK2與枯草芽孢桿菌的相似性大于99%，鑒定ZK2為枯草芽孢桿菌。

對ZK2產酶條件進行初步優化，產酶條件在培養溫度38 ℃、初始pH 8.0、接種量15%、發酵周期54 h時最優。劉程程等[1]篩選到的一株木聚糖酶高產菌株FJAT-14260（沙福芽孢桿菌 Bacillus safensis），最適培養溫度為30 ℃，最適初始pH為7.0，與FJAT-14260相比，ZK2能耐受一定的堿性；易旭東等[11]從土壤中篩選出一株堿性木聚糖酶產生菌株 YH158，培養基初始 pH 8.0產酶活性較高，為堿性酶；真菌產木聚糖酶活性較細菌高，但真菌來源的木聚糖酶一般為酸性酶[16]，堿性木聚糖酶的開發利用具有廣泛的應用前景。

目前，我國對木聚糖酶的需求日益增高，堿性木聚糖酶可應用于紡織業、造紙業等，該研究篩選到的產木聚糖酶菌株ZK2，與一些產木聚糖酶菌株相比，有較高的耐堿性，具有一定的應用開發價值。

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