水楊酸酰化對胭脂蘿卜天竺葵素穩定性和抗氧化活性的影響

梁 姍，劉 歡

長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408100

花青素(anthocyanin)是黃酮屬的天然色素，廣泛的存在于具有不同顏色的植物中，如藍莓、黑莓和紫甘薯等，在自然狀態下往往與各種糖苷形成花青苷[1，2]。研究表明，花青素具有清除自由基、保護心血管系統、抗癌、皮膚保健和抗衰老等功能[3-5]。從植物中提取天然花青素的技術較成熟，但花青素容易受到金屬離子、二次色素、溫度、光照、pH值等因素的影響，導致色素降解及活性降低[6-8]。研究發現酰化可以改善對花青素的顏色保護，提高青素的穩定性。朱玉良等[9]發現對黑枸杞花青素進行蘋果酸酰基化改性使其半衰期和保留率均顯著上升。趙立儀等[10]發現酰化藍莓花青素及矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對溫度、光照、強氧化劑、食品添加劑的穩定性有顯著提高。胭脂蘿卜(carmine radish)是重慶市涪陵區特有的蔬菜品種，主要用于制備食用紅色素，研究發現其紅色素為花青素類天竺葵素，具有良好的抗氧化、抑菌性，但其穩定性較差，如何進一步提高其穩定性成為該色素開發和利用的關鍵[11-13]。本研究采用水楊酸酰化分離自胭脂蘿卜的天竺葵素，探討其對光照、溫度、pH、抗氧化性等的穩定性，為該色素的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

天竺葵素采用液相色譜儀分離自胭脂蘿卜(純度> 95%)，由長江師范學院天然產物研究實驗室分離獲得；無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸鎂、雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸鋁、鹽酸、氯化鈉均為國產分析純，為重慶川東化工(集團)有限公司產品；水楊酸為上海遠帆助劑廠產品；維生素C為上海伊卡生物技術有限公司產品。

ΜLtiMate 3000 XR液相色譜儀，美國 Thermo 公司產品 ；Optima MAX-XP，冷凍超速離心機 德國 Beckman 公司產品； UV 3010紫外-可見分光光度計，日本日立科學儀器有限公司產品；UPT 超純水制造機，中國優普公司產品。

1.2 方法

1.2.1 天竺葵素的酰化處理

稱取1.0 g水楊酸加入2 mL沸水溶解，溶解后的水楊酸溶液與天竺葵素溶液按照濃度比1∶1 (w/w)混合，在28 ℃下反應2 h，將反應液稀釋后用紫外分光光度計在200～600 nm波長范圍內進行快速掃描，結果根據在300～350 nm處吸收峰變化來確定酰化[14]。

1.2.2 酰化天竺葵素保留率的測定方法

采用天竺葵素標準品(HPLC≥98%， CAS：134-04-3)作標準曲線，測定胭脂蘿卜天竺葵素的含量，并通過含量比計算保留率[15]。

保留率(%)=(保存后天竺葵素含量/初始天竺葵素含量)×100

1.2.3 各因素對酰化胭脂蘿卜天竺葵素穩定性的影響

1.2.3.1 天竺葵素的光穩定性

各取未酰化和酰化30 mL天竺葵素裝至白色透光的試劑瓶中，放在自然光照條件的壞境中，隔天定時測定其保留率的變化，共測5天。

1.2.3.2 天竺葵素的熱穩定性

取酰化與未酰化的天竺葵素溶液各30 mL置于80、100、120 ℃，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.3.3 金屬離子對天竺葵素的影響

各取酰化與未酰化的天竺葵素每份30 mL，分別加入濃度為0.01 mol/L的硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋁、硫酸鋅溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.3.4 pH對天竺葵素的影響

將酰化與未酰化的天竺葵素分別用鹽酸和氫氧化鈉溶液調節酸堿度，分別測定pH為2、4、6、8、10、12含量的變化。

1.2.3.5 H2O2對天竺葵素的影響

各取未酰化和酰化的30 mL天竺葵素，分別加入濃度為1%、2%、3% VC溶液和1%、5%、10%過氧化氫溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測定其含量變化。

1.2.4 胭脂蘿卜天竺葵素抗氧化活性評價

1.2.4.1 羥基自由基(·OH)的清除

取2 mL 6 mmol/ L硫酸亞鐵溶液、2 mL 6 mmol/ L水楊酸溶液及、2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，最后加入2 mL H2O2，混合均勻后37 ℃恒溫水浴中反應30 min，4 000 rpm冷凍離心5 min，取上清液在510 nm下測吸光度作為試驗組，記為Ai；用蒸餾水代替樣品作為空白組，記為A0；以蒸餾水代替H2O2作為對照組，記為Ai0；用VC作為陽性對照，按下式計算對自由基的清除率[16]：

1.2.4.2 DPPH自由基的清除

取2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，加入2 mL的 DPPH溶液作為試驗組，在黑暗環境下反應30 min后，在波長517 nm下測定其吸光度(Ai)；以2 mL待測溶液加入2 mL的無水乙醇作對照(Ai0)，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作空白(A0)，用VC作陽性對照，計算對DPPH自由基的清除率[17]：

1.2.4.3 ABTS自由基的清除

取10 mL，7 mmol/L ABTS和176 μL，140 mmol/L過硫酸鉀混合均勻置于黑暗處室溫反應24 h，得到儲備液。再用乙醇稀釋成工作液，在734 nm波長下吸光度在0.68～0.72范圍內。分別移取0.1 mL不同濃度的天竺葵素溶液于25 mL比色管中，再添加5 mL ABTS工作液，混合均勻后在室溫下反應30 min，于734 nm下測其吸光度，作為試驗組記為Ai；用蒸餾水代替天竺葵素溶液作為空白組記為A0；用乙醇代替ABTS工作液作為對照組記為Ai0。按下列公式計算ABTS自由基的清除率[18]：

2 結果

2.1 酰化胭脂蘿卜天竺葵素的紫外吸收光譜

測定胭脂蘿卜天竺葵素在200～600 nm的吸收光譜，觀察在300～350 nm 的波峰情況，如有波峰變化則說明發生了酰基化[15]。如圖1所見，胭脂蘿卜天竺葵素與水楊酸發生酰化反應后，在紫外光譜中317 nm處出現吸收峰，說明胭脂蘿卜天竺葵素已經酰化。

圖1 胭脂蘿卜天竺葵素的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of pelargonidin注：A:未酰化；B:酰化；↓:酰化吸收峰。Note:A:unacylation;B:acylation;↓:acylation absorption peak.

2.2 酰化天竺葵素對光照穩定性的影響啊

由圖2可見，10天內隨光照時間的延長，未酰化與酰化天竺葵素保留率均逐漸下降，酰化天竺葵素的穩定性均顯著高于未酰化的天竺葵素(P<0.05)，光照第10天時，酰化天竺葵素的保留率在81.28%左右，而未酰化天竺葵素的保留率已降到61.33%左右。酰化后的天竺葵素的光穩定性顯著高于未酰化天竺葵素(P<0.05)。

圖2 光照對天竺葵素保留率的影響Fig.2 The effect of illumination on the retention rate of pelargonidin

2.3 酰化天竺葵素對溫度穩定性的影響

由圖3可見，隨著溫度的升高和時間的延長，酰化前后天竺葵素的保留率均下降。在80 ℃下2 h后，酰化天竺葵素保留率均顯著大于未酰化天竺葵素(P<0.05)。在100 ℃下2 ～6 h，酰化天竺葵素保留率與未酰化天竺葵素沒有顯著性差異，在8 ～10 h時差異極顯著(P<0.01)。120 ℃下2 ～4 h，酰化與未酰化天竺葵素保留率沒有顯著性差異，在6 ～10 h時差異顯著(P<0.05)。在80、100、120 ℃加熱10 h后酰化天竺葵素保留率分別為81.59%、71.82%、58.03%，未酰化天竺葵素為71.59%、60.04%、49.27%，酰化天竺葵素均顯著高于未被酰化天竺葵素，說明酰化天竺葵素的熱穩定性顯著提高。

圖3 溫度對天竺葵素保留率的影響Fig.3 The effects of temperature on the retention rate of pelargonidin注：A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃。Note:A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃.

2.4 酰化天竺葵素對金屬離子穩定性的影響

由圖4可知，隨著反應時間的增長，0.01 mol/L的四種金屬離子對未酰化和酰化天竺葵素的穩定性均有顯著影響(P<0.05)。其中Fe2+、 Mg2+、Zn2+對未酰化與酰化天竺葵素的保留率影響差異不顯著，而Al3+對已酰化和未酰化天竺葵素的穩定性影響有顯著性差異(P<0.05)，說明酰化后的天竺葵素對金屬離子的穩定性和金屬離子的類型有關，對Fe2+、Mg2+和Zn2+穩定性好于Al3+。

圖4 金屬離子對天竺葵素保留率的影響Fig.4 The effect of metal ion the retention rate of pelargonidin注：A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+。Note:A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+.

2.5 酰化天竺葵素對pH穩定性的影響

天竺葵素受pH影響較大，當pH值小于3時，天竺葵素呈穩定的紅色；當pH值在3～6范圍之間時，紅色變淺；當pH值大于6時，呈不穩定的藍色[19]。由圖5可知，胭脂蘿卜天竺葵素在pH<6時，即酸性條件下較為穩定，在堿性條件下保留率下降顯著(P<0.05)。酰化天竺葵素的保留率顯著高于未酰化的天竺葵素(P<0.05)。

圖5 pH對酰化天竺葵素保留率的影響Fig.5 The effect of pH on the retention rate of pelargonidin

2.6 酰化天竺葵素對H2O2穩定性的影響

由圖6可知，在反應2～8 h內，添加10%過氧化氫對天竺葵素的保留率無顯著影響(P>0.05)，在8 h后，酰化天竺葵素的保留率顯著高于未酰化天竺葵素(P<0.05)，說明在長時間反應后酰化天竺葵素對強氧化劑的穩定性提高，而且短時間內酰化天竺葵素的優勢并不顯著。

圖6 H2O2對天竺葵素保留率的影響Fig.6 The effect of H2O2 on the retention rate of pelargonidin

2.7 酰化天竺葵素抗氧化活性評價

2.7.1 對羥自由基(·OH)的清除效果

由圖7可知，當酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素與VC濃度在0.5 ～2.5 mg/mL內時，對羥基的清除率均隨濃度的增加而增大。相同濃度的VC對羥自由基的清除率均低于天竺葵素(P<0.05)，酰化前

圖7 天竺葵素對羥自由基的清除率Fig.7 Pelargonidin removal rate of hydroxyl radicals

后天竺葵素對羥自由基的清除能力未見顯著差異，說明胭脂蘿卜天竺葵素具有良好的羥自由基清除能力，且水楊酸酰化未影響其清除羥自由基的能力。

2.7.2 對DPPH自由基的清除效

如圖8所示，當在0.2～0.8 mg/mL間，酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素和VC對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加。當濃度達到0.8 mg/mL時，天竺葵素對DPPH清除率達到最高，但低于VC(P<0.05)，酰化前后天竺葵素對DPPH自由基具有相當的清除效果，說明酰化未影響天竺葵素對DPHH自由基的清除能力。

圖8 天竺葵素對DPPH自由基的清除率Fig.8 Pelargonidin removal rate of DPPH radicals

2.7.3 對ABTS自由基清除的效果

如圖9所示，酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素和VC均對ABTS自由基具有明顯清除作用，當濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內時，對ABTS自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加，同等濃度下VC對ABTS的清除率高于天竺葵素，當濃度達到0.8 mg/mL后，VC對ABTS自由基清除幾乎達到飽和，1 mg/mL天竺葵素對ABTS自由基清除率達75.2%，酰化前后天竺葵素對ABTS自由基的清除率無顯著性差異，說明酰化并未影響天竺葵素對ABTS自由基的清除能力。

圖9 天竺葵素對ABTS自由基的清除率Fig.9 Pelargonidin removal rate for ABTS radicals

3 結論

通過對胭脂蘿卜天竺葵素的穩定性進行探究，研究表明天竺葵素的穩定性在一定范圍內與光照、溫度呈反相關，氧化劑、金屬離子、pH對其穩定性也有較大影響。采用水楊酸為酰化劑，對胭脂蘿卜天竺葵素進行酰化，發現酰化天竺葵素在溫度高于80 ℃，光照2天、增加Al3+及不同的pH條件下，穩定性均高于未酰化天竺葵素，酰化與未酰化天竺葵素對Fe2+、Mg2+和Zn2+以及H2O2無顯著影響。說明酰化使得其耐高溫、耐光性能有了較大的改良，對工業生產過程中的溫度及光照有更好的耐受性。

研究還對酰化及未酰化天竺葵素進行各項抗氧化指標測定，分析水楊酸酰化對天竺葵素的體外抗氧化活性的影響，發現酰化天竺葵素對羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力與未酰化天竺葵素無顯著差異，表明水楊酸酰化天竺葵素的穩定性優于未經修飾的天竺葵素，且對其抗氧化活性無影響影響，有較高的開發應用和研究價值，其機理及應用技術還需進一步研究。