急性腦梗死患者血清中miR-15b表達變化及臨床意義

黃寶和 是明啟 張弘娟 黃娟

研究表明[1-2]，早期識別病因及準確預測病情變化對指導急性腦梗死患者治療及預后改善具有重要意義。miR-15b 作為 miR-15/16 家族成員，是廣泛存在于機體各系統特別是血管內皮系統中的一類miRNA，與血管內皮細胞生物學行為密切相關[3]，可通過調控血管生成相關基因表達而參與子宮內膜異位癥發生[4]，有研究指出[5]，miR-15b 作為抑制血管新生分子與腦梗死后側支循環建立相關。本研究分析急性腦梗死患者外周血中miR-15b 表達變化，探討其與患者病情及側支循環建立的相關性。

資料與方法

1.一般資料 選取2016年3月至2017年9月，在我院神經內科住院治療的急性腦梗死患者165例，其中，男性 91 例，女性 74 例，年齡 34 ～78 歲，平均年齡(60.96±10.96)歲，納入標準：①均符合《中國急性缺血性卒中診治指南2014》中相關診斷標準；②首次發病，且入院時間距離發病在24 h 以內；③均經頭部影像學檢查確診。排除標準：①復發性腦梗死；②肝腎等重要臟器嚴重功能障礙者；③急慢性感染、嚴重創傷、惡性腫瘤、自身免疫系統疾病、先天性心臟病、心力衰竭、心瓣膜病、急性心包炎、肺動脈栓塞者，以及酗酒、服用避孕藥物者。同期，從體檢中心選取健康體檢者50 例作為對照組，其中，男性 27 例，女性 23 例，年齡 33 ～80 歲，平均年齡(60.86±14.37)歲，與病例組在性別、年齡差異無統計學意義(χ2= 0.021，P= 0.886；t= 0.743，P=0.458)，均衡可比。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有研究對象均行知情同意。

2.主要試劑與設備 Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，反轉錄和 PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，miR-15b 和內參引物由上海生工生物公司設計合成，實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI公司，血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素-2(Ang-2)檢測試劑盒購自上海西唐生物有限公司。

3.方法 (1)神經功能缺損評分：按照美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)對急性腦梗死患者神經功能缺損程度進行評分，將患者分為三組：輕型組(＜4 分，n=72)、中型組(4 ～15 分，n=69)和重型組(＞15 分，n=24)。

(2)全腦數字減影血管造影(DSA)檢查：所有腦梗死患者在簽署知情同意書后，于入院5 d 時接受DSA 檢查。利用德國Neurostar 公司生產的雙C壁數字減影血管造影機完成檢查，用改良的Seldinger 術穿刺股動脈，用5F 的Pigtail 導管先對主動脈弓進行造影，觀察弓上各大血管開口情況，然后以5-F 單彎導管分別對雙側頸總動脈、鎖骨下動脈選擇性造影。采集速率4 幀/s，充分顯示動、靜脈期的血管影像。按照美國介入放射協會及神經放射介入治療協會(ASITN/SIR)關于腦缺血后側支血流分級標準進行分級[6]：0 級：缺血區無側支血流；1 級：缺血區周邊有緩慢的側支血流；2 級：缺血區周邊及部分缺血區可見快速側支血流；3 級：缺血區可見緩慢的側支血流；4 級：整個缺血區均可有快速側支血流到達。0～1 級為側支循環未完全組；2 ～4 級為側支循環建立組。

(3)腦梗死體積評估：依據急性腦梗死患者MRI 影像學檢查結果，按照Pullicino 法對梗死灶體積進行評估[7]，并分為小梗死組(梗死灶體積＜5 cm3)、中梗死組(5 cm3≤梗死灶體積＜10 cm3)和大梗死組(梗死灶體積≥10 cm3)。

(4)血清中miR-15b 表達水平檢測：患者于入院次日和對照組于體檢當日抽取空腹靜脈血5 mL，1 600 r/min，離心15 min 后，留取血清，保存于-80℃冰箱以備用。按Trizol 試劑盒說明提取總RNA，檢測總RNA 純度和濃度。按逆轉錄試劑盒說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。使用實時熒光定量PCR儀，以cDNA 為模板用PCR 試劑盒進行引物擴增，每個樣品設3 個復孔。引物序列：miR-15b：上游：5 ’-AGCAGCACATCATGGTTTAC-3 ’，下 游：5 ’-GTGCA GGGTCCGAGGT-3’； U6：上 游：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’，下游：5’-TCGGCAGCACATATACT AA-3’。PCR 條件：95 ℃ 5min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，74 ℃ 30 s，連續循環 40 次。以 U6 為內參，用 2-△△Ct法計算 miR-15b 相對表達量。

(5)酶聯免疫吸附試驗(ELISA 法)檢測血清中VEGF 和Ang-2 濃度：取血清，利用 ELISA 法檢測血清中VEGF 和Ang-2 濃度，所有操作均在標準實驗室內按試劑盒說明完成。

4.統計學分析 使用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 差異有統計學意義。

結 果

1.急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 急性腦梗死患者血清中miR-15b 相對表達量、VEGF 和Ang-2 濃度均高于對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表1 急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

項目 急性腦梗死患者(n=165)對照組(n=50) t 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.62±0.27 1.00±0.07 16.107 0.000 VEGF/(ng/L) 283.33±35.18 197.61±12.25 17.688 0.000 Ang-2/(ng/L) 41.65±7.80 24.44±2.45 15.356 0.000

2.不同側支循環建立組患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 側支循環建立組患者血清中miR-15b 相對表達量低于側支循環未完全組，而VEGF 和Ang-2 濃度高于側支循環未完全組(P＜0.05)，見表2。

表2 不同側支循環建立組患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表2 不同側支循環建立組患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

項目 側支循環未完全組(n=67)側支循環建立組(n=98) t 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.93±0.12 1.57±0.10 25.197 0.000 VEGF/(ng/L) 267.94±17.22 303.35±23.96 10.396 0.000 Ang-2/(ng/L) 34.26±2.42 47.28±3.17 28.402 0.000

3.不同神經功能缺損評分患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度 與輕型組比較，中型組和重型組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜ 0.05)，與中型組比較，重型組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，見表3。

4.不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 與小梗死組比較，中梗死組和大梗死組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，與中梗死組比較，大梗死組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而 VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，見表4。

表3 不同神經功能缺損評分患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表3 不同神經功能缺損評分患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

注：與輕型組比較，aP＜0.05；與中型組比較，bP＜0.05

項目 重型組(n=24) 中型組(n=69) 輕型組(n=72) F 值 P 值miR-15b 相對表達量 2.12±0.16ab 1.68±0.11a 1.40±0.08 434.937 0.000 VEGF/(ng/L) 240.07±20.85ab 274.09±23.31a 315.78±21.24 127.187 0.000 Ang-2/(ng/L) 31.87±3.29ab 36.66±2.90a 49.69±2.61 539.232 0.000

表4 不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表4 不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

注：與小梗死組比較，aP＜0.05；與中梗死組比較，bP＜0.05

項目 大梗死組(n=39) 中梗死組(n=69) 小梗死組(n=57) F 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.91±0.15ab 1.58±0.10a 1.48±0.07 201.696 0.000 VEGF/(ng/L) 256.60±17.35ab 279.23±21.36a 316.52±19.72 107.601 0.000 Ang-2/(ng/L) 28.52±2.83ab 43.95±2.95a 56.93±3.58 1025.818 0.000

討 論

miRNA 在血管內皮細胞增殖、凋亡、侵襲、成管等多種生物學行為中發揮重要作用[8]，同時，參與了神經系統發育及功能形成過程[9-10]。動物實驗表明[11]，急性腦缺血大鼠腦組織中miRNA 表達譜改變。亦有研究指出[12]，急性腦梗死患者外周血中miRNA 表達譜發生了改變。本研究結果顯示，急性腦梗死患者血清中miR-15b 相對表達量較對照組升高，說明miR-15b 可能參與了急性腦梗死發生過程。

有研究指出[13]，側支循環建立是提高急性腦梗死患者缺血區血流灌注的關鍵。對減少梗死區域體積、改善患者預后及減少復發具有重要意義[14]。缺血性卒中梗死灶周圍血管新生建立側支循環涉及眾多的細胞因子，包括直接介導血管新生的因子(如VEGF、內皮祖細胞和Ang)，以及間接介導血管新生的因子(如蛋白金屬蛋白酶、肽類因子、人肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、低氧誘導因子-1α、轉化生長因子-β1 等)[15]。VEGF 作為一種直接介導血管新生的因子，可通過促進血管內皮細胞增殖、增加血管通透性、維護血管完整性等而參與了血管生成[16]。動物實驗表明[17]，VEGF 表達上調可促進腦缺血組織區新生血管形成，對缺血性卒中具有保護作用。有研究用鼠神經生長因子肌肉注射治療急性腦梗死患者發現[18]，鼠神經生長因子可促進患者外周血中VEGF 表達，從而改善腦梗死后神經功能缺損癥狀。Ang-2 作為分泌型細胞因子，可與VEGF 產生協同作用，增強內皮細胞對VEGF 的敏感性，促進血管新生[19]。本研究結果顯示，急性腦梗死患者血清中 VEGF 和 Ang-2 濃度升高，說明VEGF 和Ang-2 與急性腦梗死發病有關，與以往報道結果相同[20]。本研究結果顯示，與側支循環未完全組比較，側支循環建立組患者血清中miR-15b 相對表達量降低，而VEGF 和Ang-2 濃度升高，進一步說明miR-15b 可能作為一種抑制血管生成的因子而參與了側支循環建立過程。但由于DSA 所評估的側支循環與VEGF 誘導生成的新生血管是否匹配還需要進一步論證，因此，miR-15b 與側支循環建立間的關系尚待進一步研究明確。

有研究指出[21]，有側支循環開放患者的入院時神經功能好于無側支循環。本研究結果顯示，隨著神經功能缺損評分增加，患者血清中miR-15b 表達量升高，而 VEGF、Ang-2 濃度降低，說明 miR-15b 表達可能通過影響側支循環建立而與神經功能缺損嚴重程度有關。本研究結果顯示，隨著腦梗死體積增加，患者血清中 miR-15b 相對表達量均升高，而VEGF 和Ang-2 濃度降低，說明 miR-15b 表達與腦梗死體積有關，分析原因，在缺血、缺氧狀態下，繼發氧化應激及炎癥反應，且腦梗死體積越大、病情越重，這種反應越激烈[22]。

綜上所述，miR-15b 在急性腦梗死患者血清中呈高表達，可能通過靶蛋白VEGF 而參與側支循環建立，且與患者病情嚴重程度及腦梗死體積呈正相關，有望為急性腦梗死早期診斷及病情評估提供依據，但仍需要擴大樣本量進一步研究。