奶牛乳房炎常見致病菌的分離及藥敏試驗

吳海燕 王純結 敖日格樂 姜 艷 裴大偉

1.內蒙古自治區興安盟科爾沁右翼前旗動物疫病預防控制中心，內蒙古興安盟科右前旗137400；2.內蒙古農業大學，呼和浩特010018

奶牛乳房炎主要由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等致病菌引起[1-2]。目前治療奶牛乳腺炎首選抗生素，但隨著耐藥菌株的不斷增多和耐藥性的不斷變化，抗生素的殘留問題日益突出[3]，迫切需要一種安全、綠色的奶牛乳腺炎治療方法。蒙藥由純天然的礦植物組成，含有多種生物有效成分。本研究通過對患有奶牛場乳房炎的牛奶樣中分離出的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌進行體外抑菌試驗，初步探討奶牛乳房炎主要致病菌的耐藥特征并比較2 種蒙藥與抗生素抗菌差異，為該蒙藥復方的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）奶樣采集。奶樣采自呼和浩特市周圍奶牛場50頭患有臨床型乳房炎的奶牛。用溫水清洗乳房，擦干后用2 g/L 的新潔爾滅和酒精棉對奶牛乳房進行消毒，棄去前2～3 把奶，每頭采奶樣約4 mL 于滅菌的離心管中，加蓋封緊，標明牛號。

2）培養基及試劑。營養肉湯、營養瓊脂平板、麥康凱培養基、伊紅美蘭培養基、高鹽甘露醇培養基、5%綿羊鮮血瓊脂平板、血清平板，均按說明書配制；藥敏紙片和生化鑒定所用的微量發酵管，以上均購自廣東環凱生物科技有限公司。

3）試驗儀器。HPS-250 生化培養箱、FLC-3 超凈工作臺、BP211D 電子天平、全不銹鋼立式高壓滅菌鍋。

1.2 試驗方法

1）奶牛乳房炎病原菌分離、鑒定試驗。將采集的乳樣分別在普通瓊脂平板、5%綿羊鮮血瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板上進行劃線培養(37 ℃,24 h)，觀察細菌菌落生長情況，并進行涂片、鏡檢和純培養[4]。根據細菌生化鑒定試劑盒說明進行生化鑒定。

2）蒙藥復方藥敏試驗。將金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌接種于普通肉湯培養基中，37 ℃培養18 h。用營養肉湯校正濃度至0.5 麥氏比濁標準，約含1×108～2×108CFU/mL。將其稀釋100 倍至1×106～2×106CFU/mL。用“L”型涂菌棒均勻涂布于整個培養基表面。用置杯器放置牛津杯，分別將100 μL 藥液加入制備好的帶有菌層平皿中的牛津杯內，蓋好，37 ℃培養24 h。游標卡尺測量抑菌圈直徑。大于15 mm 為極度敏感；大于10 mm 且小于15 mm 為高度極敏；大于8 mm 且小于10 mm 為敏感；小于8 mm 為不敏感[5]。

3）抗生素藥敏試驗。紙片擴散法(K-B 法)，將分離菌純化后進行藥敏試驗，37 ℃,24 h 培養后測量各種藥物的抑菌環直徑。試驗結果判定：參照NCCLS (2007)公布的標準以敏感(susceptible)、中敏(intermediate)和耐藥(resistant)3 種形式對抑菌圈大小進行分類。耐藥率=耐藥菌株數/試驗菌株數×100%。

2 結果與分析

2.1 常見致病菌的分離鑒定

1）培養及染色特性。奶牛乳房炎病原菌培養顯示，A 類菌呈單個，短粗，菌體較小，革蘭氏染色反應為陰性，在伊紅美藍上形成黑色有金屬光澤、光滑、濕潤、隆起的中等大小菌落，在普通瓊脂和血瓊脂上為圓形乳白色菌落。B 類菌呈圓形或橢圓形，較大，單個或成對，個別有四聯球菌，革蘭氏染色反應為陽性，在普通瓊脂和血瓊脂上生長良好，形成金黃色或白色小菌落，金黃色菌落在血瓊脂上呈明顯的溶血，白色菌落在血瓊脂上不溶血。C 類菌呈圓形，革蘭氏染色反應為陽性，成短鏈狀排列，在普通瓊脂上為白色或灰白色細小菌落。在血瓊脂上為灰白色半透明、隆起、粘稠的小菌落，有的有明顯的β溶血。

2）動物試驗。注射鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的小鼠初期出現肌肉震顫、精神沉郁等癥狀，以后精神逐漸恢復，48 h 內有3 只死亡，用培養基回收到攻毒菌。

3）生化鑒定。將分離到的36 個菌株進行純培養并采用生化試驗進行鑒定，結果見表1～表3，表1～表3中，“+”表示陽性，“-”表示陰性。

表1 A 類菌株生化反應試驗結果

表2 B 類菌株生化反應試驗結果

表3 C 類菌株生化反應試驗結果

表4 蒙藥復方藥敏試驗結果（抑菌圈直徑M±S）

根據培養、形態、染色以及生化試驗結果及參考文獻[6]，可初步判定所分離菌中A 類為大腸桿菌，B 類為金黃色葡萄球菌，C 類為鏈球菌（C1 無乳鏈球菌，C2 為停乳鏈球菌）。對所分離病原菌進行鑒定，結果為：從50 份樣品中分離細菌，經培養特性、染色鏡檢、生化鑒定等試驗，鑒定出無乳鏈球菌13 株，占分離菌的27%，大腸桿菌17 株，占分離菌的35%，金黃色葡萄球菌18 株，占分離菌的37%。其中，9 份乳樣則未檢出細菌，可能為非特異性乳房炎或者是由其他病原微生物引起。

2.2 蒙藥復方藥敏試驗

對分離到的致病菌進行傳統蒙藥復方和正交蒙藥復方藥敏試驗。由表4可知，正交蒙藥復方和傳統蒙藥復方對金葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌的抑菌圈均大于15 mm，為極敏感，有效地抑制病原菌的生長。2 種蒙藥復方之間無顯著性差異（ ＞0.05）。

2.3 抗生素藥敏試驗

選擇性對分離到的致病菌株進行了5 類共11種藥物敏感試驗。由表5可見，大腸桿菌對慶大霉素、卡那霉素、環丙沙星、阿米卡星、鏈霉素等藥物高度敏感；對克林霉素、紅霉素、四環素等藥物中度敏感；對青霉素、阿莫西林、頭孢噻吩等藥物不敏感，耐藥率達到94%以上。金黃色葡萄球菌對慶大霉素、卡那霉素、環丙沙星、阿米卡星等藥物高度敏感；對鏈霉素、四環素、紅霉素等藥物中度敏感或不敏感；對青霉素、阿莫西林、克林霉素、頭孢噻吩等藥物耐藥率分別為100%、88.9%、94.4%、94.4%。而鏈球菌對慶大霉素和阿米卡星高度敏感；對卡那霉素、四環素、紅霉素、阿莫西林、環丙沙星、頭孢噻吩等中度敏感；對青霉素及克林霉素、鏈霉素不敏感，耐藥率達到84.6%以上。

3 討 論

導致奶牛乳房炎的病原微生物種類繁多，有細菌、真菌、病毒、支原體等，但95%以上都是由細菌引起的[7-8]。本研究經細菌培養特性、形態染色特性、生化特性等鑒定表明，50 份奶樣中共分離到48 個菌株，其中A 類17 個菌株為大腸桿菌，占分離菌的35%；B 類18 個菌株為金黃色葡萄球菌，占分離菌的37%；C 類13 個菌株則為鏈球菌，占分離菌的27%。本試驗分離鑒定的細菌種類及所占的比例情況，與其他文獻報道的其他地區奶牛乳房炎細菌鑒定結果略有不同[9-10]，其原因可能是由于各地氣候、地理位置以及不同地區牛場的衛生管理措施存在差異有關。

當長期應用抗菌藥物時，敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株不斷大量繁殖，代替敏感菌株，促使細菌對抗菌藥物的耐藥率不斷升高。本研究抗生素藥敏驗結果表明，鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌有較強的抑菌效果，尤其是卡那霉素效果突出。β-內酰胺類中青霉素類藥物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌抑菌效果不明顯。頭孢噻吩對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果較差，克林霉素對金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌活性較差，大環內酯類的紅霉素對鏈球菌，金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，環丙沙星對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用。劉大成等[11]報道金黃色葡萄球菌對四環素、慶大霉素、卡那霉素等藥物高度敏感；鏈球菌對紅霉素、喹諾酮類以及慶大霉素等均高度敏感，大腸桿菌對四環素、慶大霉素、喹諾酮類等均高度敏感，而對青霉素均產生了不同程度的耐藥性；與本試驗結果基本相符。鄧海平等[12]報道，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌對青霉素、紅霉素具有較強的耐藥性，對環丙沙星、慶大霉素較為敏感，本試驗結果與其基本相符。

表5 抗生素藥敏試驗結果

蒙藥復方藥敏試驗結果顯示，2 種蒙藥復方對所分離的病原菌有較好的抑制作用，為蒙藥治療奶牛乳房炎提供了有力的依據。隨著抗生素耐藥性的日趨增強，急需開發能夠替代抗生素，且毒副作用小、無殘留的產品。有研究表明，蒙藥制劑不但能夠直接抑殺病原微生物，而且能夠提高機體的免疫機能。因此，蒙藥在治療乳房炎方面具有很大發展前景。