荷葉中荷葉堿的浸提動(dòng)力學(xué)模型研究*

韓婷婷，任曉亮，任德飛，王 萌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

荷葉（Nelumbins Folium）系睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的干燥葉[1]，味苦澀，性平，有清熱解暑，升發(fā)清陽，涼血止血的功效，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉、脾虛泄瀉，熱血吐衄，便血崩漏等[2]。中國自古以來就把荷葉奉為瘦身的良品。其被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為“可用于保健食品的藥品”[3]。目前為止，從荷葉中已經(jīng)鑒定出十五種生物堿，為荷葉堿、亞美罌粟堿、原荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、番荔枝堿等，其中荷葉堿為中藥荷葉中的主要藥效活性成分[4-9]。荷葉堿（nuciferine）是一種阿樸啡型生物堿，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明荷葉堿具有明顯的降脂、平衡膽固醇導(dǎo)物、較強(qiáng)的抑制細(xì)菌和霉菌等以及在體外顯著的抗脊髓灰質(zhì)炎病毒等活性[9-12]。目前有大量文獻(xiàn)記載了如何高效提取荷葉堿的方法，然而卻很少有從理論的角度出發(fā)研究其提取規(guī)律或者提取條件與提取量的關(guān)系變化。因此，本實(shí)驗(yàn)選取溫度、溶劑種類及溶劑量作為考察內(nèi)容，基于Fick第一定律建立動(dòng)力學(xué)模型，對(duì)荷葉浸提動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行擬合，以期從理論上研究各因素與有效成分濃度之間的關(guān)系，并提高有效成分提取率。

1 材料

超高效相色譜儀（Waters ACQUITY UPLCTM，美國Waters公司）；高效液相色譜儀（Shimadzu LC-20AT，日本 Shimadzu公司）；實(shí)驗(yàn)室超純水儀（Milli-QAcademic，美國 Millipore公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電動(dòng)攪拌器（S312-90，山海申生科技有限公司）；pH 計(jì)（PB-10，德國 Sartorius公司）；十萬分之一天平（BT125D，德國Sartorius公司）；電子天平（JA31002，上海精天電子儀器有限公司）；超聲波清洗器（KH3200B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-s8，金壇盛藍(lán)儀器制造有限公司）；藥典篩（2，4，5，6，7號(hào)篩，浙江上虞市五星沖壓篩具廠）。

荷葉堿（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111566-2000703，含量 99.7%）；荷葉（山東，鑒定專家：天津中醫(yī)藥大學(xué)，李天祥教授）；乙腈（美國sigma公司，色譜純）；乙醇（天津市康科德科技有限公司，分析純）；甲酸（天津化學(xué)試劑批發(fā)公司，色譜純）；冰乙酸（天津市康科德技術(shù)有限公司，色譜純）；三乙胺（天津市元立化工有限公司，色譜純）；蒸餾水，屈臣氏集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters SymmetryTMC18（150×3.9 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸=27∶70.6∶1.6∶0.78；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：270 nm；進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 荷葉堿對(duì)照品的HPLC圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精密稱量荷葉堿對(duì)照品4.04 mg，置于5 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，得到808μg/mL的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密量取儲(chǔ)備液適量逐級(jí)稀釋4～1 026倍，得到0.787～202μg/mL的對(duì)照品溶液，由低到高濃度分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。

以荷葉堿質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：Y=3.798 8×104X-2.1470×104（r=0.999 9），荷葉堿質(zhì)量濃度在0.787～202μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（12.65μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取10 g荷葉樣品置500 mL具圓底燒瓶，加入150 mL 95%乙醇，置恒溫水浴鍋中65℃浸提2 h，取樣適量離心（12 000 r/min，5min），上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾液稀釋進(jìn)樣分析，平行制備6份，計(jì)算重復(fù)性為1.5%。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取荷葉樣品，配制好溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，RSD 為2.1%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率測(cè)定 收集提取10 min時(shí)的樣品液，精密加入16.16μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加樣回收率為98.73%，RSD為3.8%。

2.2 浸提動(dòng)力學(xué)考察

2.2.1 干藥材吸收溶劑率的測(cè)定 取10 g干燥荷葉粗粉置三頸瓶中，向其中加入95%乙醇適量，浸提2 h，測(cè)定浸提后藥液體積，得荷葉吸收溶劑率3 mL/g。

2.2.2 不同溫度下浸提動(dòng)力學(xué)研究 荷葉（取藥典5，6號(hào)篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入95%乙醇（溶劑量 150 mL）冷凝回流，水浴加熱，于 45、55、65、75℃提取，攪拌速度60 r/min，加入乙醇時(shí)計(jì)時(shí)于 5、10、20、30、40、60、80、100、120 min 取樣 1 mL（并補(bǔ)充溶劑），離心（15 000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進(jìn)樣。

2.2.3 不同溶劑體積下浸提動(dòng)力學(xué)研究 荷葉（取藥典5，6號(hào)篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入95%乙醇冷凝回流，水浴加熱，加入溶劑體積分別為110、130、180、230 mL，65 ℃提取，加入乙醇時(shí)計(jì)時(shí)分別于 5、10、20、30、40、60、80、120 min 取樣 1 mL，離心（15 000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進(jìn)樣。

2.2.4 不同溶劑下浸提動(dòng)力學(xué)研究 荷葉（取藥典5，6號(hào)篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入30、50、70、95%乙醇（溶劑量 150 mL）冷凝回流，水浴加熱，于 65 ℃提取，加入乙醇時(shí)計(jì)時(shí)于 5、10、20、30、40、60、80、120 min 取樣 1 mL（并補(bǔ)充溶劑），離心（15000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進(jìn)樣。

2.2.5 樣品濃度的測(cè)定 精密吸取不同浸提時(shí)間下的藥液離心（15 000 r/min，2 min），立即過 0.22μm濾膜，適量稀釋進(jìn)樣分析。

2.3 數(shù)學(xué)模型的建立[13-19]中藥提取過程大致分為5個(gè)步驟：1）溶劑向荷葉藥材表面的擴(kuò)散。2）溶劑向荷葉藥材內(nèi)部的潤濕（內(nèi)擴(kuò)散）。3）藥材內(nèi)部溶質(zhì)的溶解。4）溶質(zhì)從藥材內(nèi)部向藥材表面擴(kuò)散（內(nèi)擴(kuò)散）。5）藥材表面向溶液主體的擴(kuò)散（外擴(kuò)散）。其中步驟 1）、2）為溶劑滲透，3）為溶質(zhì)溶解，4）、5）為溶質(zhì)擴(kuò)散。其中溶質(zhì)擴(kuò)散為天然藥物提取的限制步驟，步驟4的擴(kuò)散為溶質(zhì)擴(kuò)散的主要控制步驟，浸提速率完全由步驟4決定。

基于Fick第一定律建模，基本假設(shè)：1）不考慮溶劑損失；2）荷葉顆粒是球形的，為單一成分恒溫提取。

S為固液界面積；dnB/dt為通過擴(kuò)散面物質(zhì)量的時(shí)間變化率；D為擴(kuò)散系數(shù)。封閉體系中，濃度梯度隨時(shí)間變化以公式（1-2）表示。

將（1-1）帶入（1-2）：

對(duì)于稀溶液，濃度對(duì)擴(kuò)散系數(shù)影響較小，對(duì)濃溶液擴(kuò)散系數(shù)為濃度的函數(shù)。擴(kuò)散系數(shù)與溶質(zhì)濃度的冪呈正比：

D=D0DnB（n0）（1-4）

D0溶質(zhì)的固有擴(kuò)散系數(shù)。將（1-4）帶入（1-3），假設(shè)藥液中溶質(zhì)B的初始溶度為0，t時(shí)刻nB=VCB，V為藥液體積。

藥材粉碎后顆粒數(shù)為k1，顆粒粒度e，藥材總干質(zhì)量G，密度為d，

K為與藥物顆粒形狀有關(guān)的形狀參數(shù)，設(shè)K=k1/k2，得：

R：藥材吸收溶劑率，即藥材充分吸濕所需溶劑體積與干藥比值。將（1-8）、（1-9）帶入（1-5），

設(shè)U=1+b，

溶劑體積改變：公式（1-11）取對(duì)數(shù)得：

設(shè)：α=1/（1-n）ln[TtU/e]

β=1/（1-n）

公式（1-12）為中藥浸提動(dòng)力學(xué)模型，表示浸出成分與溶劑量之間的關(guān)系。V：藥液體積；e：藥材顆粒粒度；M：干藥材加入溶劑體積與干藥材質(zhì)量之比；D：擴(kuò)散系數(shù)；R：藥材充分吸濕所需溶劑與干藥材質(zhì)量之比。α、β為常數(shù)，lnC與ln（M-R）呈線性關(guān)系。

（1）浸提溫度改變

擴(kuò)散系數(shù)與溫度的關(guān)系：擴(kuò)散系數(shù)與溫度的關(guān)系：A為指前因子，E為擴(kuò)散活化能，對(duì)于特定的系統(tǒng)，均為常數(shù)。令 m=KAa（1-n）/e（m-R），得：

兩邊取對(duì)數(shù)：

N為公式（1-15）展開項(xiàng)數(shù)。浸提溫度較高時(shí)，e-B/T近似為 1－B/T，將（1-15）帶入（1-14）得：

設(shè)：

當(dāng)浸提溶劑量、藥材粒徑固定時(shí)，γ、δ為常數(shù)，lnCB與1/T呈線性關(guān)系。公式（1-17）為中藥浸提動(dòng)力學(xué)模型，表示浸出成分與溫度之間的關(guān)系。

（2）浸提溶劑改變

采用一級(jí)一項(xiàng)動(dòng)力學(xué)模型荷葉中荷葉堿動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，推到公式得：

C∞浸提平衡時(shí)溶液中功能成分的質(zhì)量濃度度；C0浸提初始時(shí)溶液中功能成分質(zhì)量濃；C隨時(shí)間t變化的溶液中功能成分質(zhì)量濃度，設(shè)荷葉浸提初始時(shí)溶液中荷葉堿成分質(zhì)量濃度為0。公式（1-18）為中藥浸提動(dòng)力學(xué)模型，表示浸出成分隨時(shí)間變化規(guī)律。基本假設(shè)：荷葉堿擴(kuò)散沿荷葉顆粒球體徑向進(jìn)行，不同溶劑浸提過程中擴(kuò)散系數(shù)為常數(shù)。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 不同溫度對(duì)荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)考察不同溫度（45，55，65，75℃）下荷葉中荷葉堿浸提結(jié)果如表1所示，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨溫度升高，荷葉堿提取量增大。不同溫度下荷葉堿浸提曲線如圖2所示。動(dòng)力學(xué)擬合方程以lnC-1/T×103作圖，結(jié)果如表2，圖3所示，擬合曲線（R＞0.95），線性關(guān)系良好，可用于描述不同溫度下荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)過程。

表1 不同溫度浸提荷葉堿含量與時(shí)間關(guān)系 μg/mL

圖2 不同溫度下荷葉堿浸提曲線

表2 不同溫度浸提動(dòng)力學(xué)考察擬合方程（X=1/T，Y=lnC）

2.4.2 不同溶劑量對(duì)荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)考察 不同提取溶劑體積下，荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)考察結(jié)果如表3所示。溶劑量為110、130、180、230 mL，荷葉藥材吸收溶劑率為3，荷葉有效浸提溶劑倍量分別為 8、10、15、20 倍。

實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨浸提體積增大，荷葉堿平衡提取量增大，浸提達(dá)到平衡的時(shí)間延長。不同溶劑量下荷葉堿浸提曲線如圖4所示。動(dòng)力學(xué)擬合方程以lnC-ln（M-R）作圖，結(jié)果如表 4、圖 5 所示，擬合曲線（R＞0.95），線性關(guān)系良好，可用于描述不同浸提體積下荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)過程。

表3 不同溶劑體積浸提荷葉堿濃度與時(shí)間關(guān)系 μg/mL

圖3 不同溫度浸提動(dòng)力學(xué)考察（lnC-1/T×103）

圖4 不同溶劑體積浸提動(dòng)力學(xué)考察

2.4.3 不同溶劑對(duì)荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)考察不同提取溶劑（30%、50%、70%、95%乙醇）下，荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)考察結(jié)果如表5所示。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，不同溶劑提取過程中存在濃度交叉，70%乙醇具有最大提取速率、提取量，浸提曲線如圖6所示。動(dòng)力學(xué)擬合方程以ln[C∞/（C∞-C）]-t作圖，結(jié)果如表6、圖7所示，擬合曲線R＞0.95，線性關(guān)系良好，可用于描述不同溶劑下荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)過程。

表4 不同溶劑量浸提動(dòng)力學(xué)考察擬合方程（X=ln（M-R），Y=lnC）

圖5 不同溶劑體積浸提動(dòng)力學(xué)擬合曲線[lnC-ln（M-R）]

表5 不同溶劑浸提荷葉堿濃度與時(shí)間考察 μg/mL

3 討論

基于Fick第一定律建立浸提動(dòng)力學(xué)模型考察不同溫度、溶劑量、溶劑種類對(duì)荷葉堿浸提規(guī)律的影響。結(jié)果，溫度升高，浸提速率及浸提量提高。隨浸提體積增大，荷葉堿平衡提取量增大。不同濃度溶劑提取過程中，存在濃度交叉，以70%乙醇提取率最高。

圖6 不同溶劑浸提曲線

表6 不同溶劑浸提動(dòng)力學(xué)考察擬合方程（ln[C∞/（C∞-C）]-t）

圖7 不同溶劑浸提動(dòng)力學(xué)考察

本研究對(duì)不同溫度、溶劑量、溶劑中荷葉浸提動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察，基于Fick第一定律建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合與推測(cè)，不同溶劑中荷葉中荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)符合一級(jí)一項(xiàng)浸提動(dòng)力學(xué)模型。建立的中藥浸提動(dòng)力學(xué)模型，相關(guān)性良好，能夠描述浸提溫度、溶劑種類、浸提體積對(duì)荷葉堿浸提動(dòng)力學(xué)的影響，為荷葉實(shí)際生產(chǎn)中提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

目前研究?jī)?nèi)容為藥材中單一成分，后續(xù)應(yīng)將所得荷葉浸提動(dòng)力學(xué)模型應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究，為確定中藥復(fù)方的最佳提取條件提供參考與數(shù)據(jù)支持。