基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量

何勝輝 楊云開 元德仿 舒易強

（七善科技有限公司，廣東 深圳 518132）

作為水體初級生產者的浮游藻類植物來說，其體內含有大量的葉綠素，而葉綠素是對水體中浮游植物進行一定光合作用的一類色素總稱。不同的浮游藻類植物中葉綠素含量各不相同。可通過利用適宜波長的光源致使葉綠素發出熒光現象，根據浮游植物發出的熒光強度推算其在水中的繁衍濃度。

1 基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量的原理及方法

水體中的浮游植物在進行光合作用時，其體內的葉綠素分子通過對光能的吸收作用，將吸收的能量一部分作為光合作用所需的能量來源，另一部分則通過熱能的形式消耗掉，最后剩余的部分才會通過熒光的形式表現出來。基于能級躍遷機理，觀察浮游植物葉綠素分子的熒光光譜與能量吸收光譜，發現熒光物質在光吸收過程中會出現一系列不同的吸收帶，但只會出現一個峰帶。從根本上講，呈自然密度繁衍的浮游植物其吸收光譜的特性基本上由其體內所含的葉綠素含量決定[1]。當使用特定波長的光照射浮游植物水溶液后，會激發浮游植物發出比入射光波長更長的熒光，其發出的熒光強度F的計算公式為：

式中：

K—熒光測量儀的儀器系數（mol/W）；

ψ—所測熒光物質的熒光系數（W/mol）；

I0—入射光的強度（W）；

ε—所測熒光物質的摩爾吸收系數（m2/mg）；

C—所測熒光物質的濃度（mol/L）；

b—樣品的光程（cm）。

對公式 （1） 進行換算整理，得出公式 （2） ，可清晰的表現出所測的熒光物質濃度C與熒光強度F之間的對數關系：

由所測的熒光物質濃度C與熒光強度F之間的換算公式發現，在熒光測量儀和需要測定濃度的熒光物質都確定的情況下，式中的k、ψ、I0、ε都將為確定的常數，由此也可確定A、B、D的值。所以，在水體的浮游植物中，其葉綠素產生的熒光強度在一定程度上和水體所含的葉綠素濃度呈相關的線性關系。因此，熒光測量儀通過檢測器將接收到的熒光轉變為電信號，然后根據接收到的電信號大小計算待測水體中浮游植物所含的葉綠素含量[2]。

2 影響熒光強度的主要因素

2.1 激發光對熒光強度測量結果的影響

雖然提高激發光的入射強度與入射時間，在一定程度上可以增強紫外熒光法測量及分析的靈敏度，但由于待測水體中的葉綠素在長時間的強烈激發光照射下容易發生降解反應，從而造成所測量的熒光強度的不準確性，引起測量結果的偏低。因此，應通過提高熒光測量儀探測器的靈敏度來增強紫外熒光法測量及分析的靈敏度，而不能通過片面的增強激發光入射強度的方法。除此之外，需要注意的一點是，在進行紫外熒光法測量水體中葉綠素含量時，要盡量縮短激勵光對待測水體的照射時長。

2.2 溫度對熒光強度測量結果的影響

雖然熒光在輻射過程中不受水體溫度變化的影響，但水體溫度的變化會影響物質的去活化過程，水體溫度越高，去活化的概率就越大。但需要注意的是，溫度過高也會使水體中的葉綠素發生降解反應。當待測水體的溫度下降時，溶液的黏度就會變大，大大降低了熒光分子與溶劑分子發生碰撞的概率，降低了去活化的概率。因此，當待測水體的溫度升高時，會大大降低熒光物質產生熒光現象的效率及其所產生的熒光強度。所以，在進行測量水體中葉綠素含量時，要盡量配備恒溫裝置，降低溫度對熒光強度的影響，提高測量結果的準確性。除此之外，還可以通過補償溫差的辦法對溫度造成的影響進行一定的降低。

3 基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量的影響因素

（1） 水體渾濁度的影響。由于水體中的懸浮物對熒光具有較強的散射作用，當水體的渾濁度越大，懸浮顆粒物就越多，散射作用就越強烈，基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量的結果就越偏高。

（2） 水體溫度的影響。由于葉綠素的結構較不穩定，高溫下容易發生降解反應，造成測量結果偏低[3]。因此利用紫外熒光法測量水體葉綠素時，最佳的水體溫度應控制在15～37 ℃。

（3） 水體pH酸堿度的影響。由于葉綠素的易降解特性，不論是在過堿或過酸的環境下都極不穩定，因此，水體的pH值對紫外熒光法測量葉綠素含量的結構會造成一定的影響，最佳的水體pH值應控制在6.0～9.5范圍內。

（4） 水體光照的影響。光照主要包括光照時間和光照強度兩個因素，當光照時間較長，光照強度較強時，葉綠素極易因光發生降解反應，造成測量結果偏低。因此，通常情況下，會在熒光測量儀上加裝避光罩，在一定程度上避免光照的影響，提高測量數據的準確性。

4 基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量的操作注意事項

4.1 采用穩定入射光源，保持激發光的單色性

由于波長λ的函數與ε摩爾吸光系數存在一定的相關性，當改變波長λ的值時，ε系數也會隨之發生改變，不再是個固定不變的常數，由此它們之間的線性關系也將不復存在。而激發光無法滿足絕對的單色性，熒光測量儀只能盡量使用小波長的復合光作為激發光源。因此，在進行測量時，可以通過選擇適宜的激發光源與濾光片等方法，獲得較為穩定的單色光源。

4.2 保證待測水質的均勻性

基于紫外熒光法測量水體葉綠素含量的郎伯-比爾定律只能用于測量均勻穩定的溶液，因此要盡可能地保證待測溶液中沒有懸濁顆粒或乳濁液等雜質存在。在使用熒光測量儀在線監測時，可以在儀器上加裝一過濾凈化裝置，過濾水體雜質，降低懸濁物的散射作用，保證所得線性關系的準確性。

4.3 降低散射光對熒光測量結果的影響

在對待測水質的熒光強度進行測量時，由于激發光對待測水體中的膠粒或盛放容器等會產生一定的散射光現象，從而限制與干擾了紫外熒光測量儀的測量靈敏度。在測量時可選擇適宜波長的激發光，減小或排除水體產生的散射光作用，以高測量結果的準確性。一般情況下，水體產生的熒光強度都較小，因此在進行熒光測量時可通過選擇適宜的狹縫寬度，既能滿足熒光強度的測量要求，又能盡量減少散射光帶來的影響。

5 結語

葉綠素熒光測量儀可在線實時監測湖泊、海洋等各種不同的水體。本文基于紫外熒光法對水體中的葉綠素含量進行測定，通過使用適宜波長的光源致使浮游植物體內的葉綠素發出熒光現象，快速檢測浮游植物發出的熒光強度，利用熒光強度與葉綠素濃度之間的線性關系，推算其在水中的繁衍濃度，從而得出水體中的葉綠素含量。