珍稀瀕危植物金絲李種子脫水耐性和貯藏特性

張俊杰 柴勝豐 王滿蓮 等

摘?要：為測定不同脫水程度金絲李（Garcinia paucinervis）種子的萌發情況及其復水后的吸水率、脫水過程中抗性生理指標的變化以及不同貯藏方式下種子的萌發情況，該文研究了金絲李種子的脫水敏感性和儲藏特性。結果表明：（1）金絲李種子初始含水量為45.29%，室內通風處放置35 d失水率即達45%。（2）種子失水率低于18%時，萌發率和復水后的吸水率變化不顯著;失水率超過18%時，萌發率和復水后吸水率均顯著下降，失水率為42%時萌發率為0。其種子的臨界含水量為27.29%，半致死含水量為12.72%。（3）隨著種子脫水程度的加深，相對電導率、可溶性糖及脯氨酸含量逐步上升;丙二醛含量在失水率低于24%時變化不大，高于24%時顯著提高;SOD和POD的活性均呈波動性變化，失水率為18%時活性均最高。（4）室溫干藏1個月和-1、-20 ℃下濕藏1個月的種子均不能萌發;水浸貯藏1個月的種子萌發率顯著降低;4 ℃濕藏1、3和6個月均顯著延緩種子萌發，但對萌發率無顯著影響。表明金絲李種子在失水率低于18%時，種子可通過抗性調節維持細胞的正常代謝，能忍受一定程度的脫水和低溫;當失水率超過18%時，種子代謝失衡發生劣變直至死亡，屬于低度的頑拗性種子。4 ℃濕沙藏（含水量7.5%）是短期貯藏其種子的較好方法。

關鍵詞：種子含水量，萌發率，脫水敏感性，頑拗性種子，種子貯藏

Abstract：We studied the dehydration sensitivity and storage characteristics of G. paucinervis seeds by measuring the germination of seeds with different dehydration extents and the water absorption after rehydration，the change of physiological indices of resistance in the process of dehydration as well as the seed germination under different storage methods. The results were as follows：（1） The initial moisture content of G. paucinervis seeds was 45.29%. The dehydration rate was up to 45% when placed after 35 d in the indoor ventilated place. （2） When the dehydration rate was less than 18%，germination percentage（GP） and the water absorption rate after rewatering were not significantly different from those of fresh seeds. However，when the dehydration rate exceeded 18%，GP and the water absorption rate after rewatering were significantly decreased，and GP was 0 at dehydration rate 42%. The critical moisture content of seeds was 27.29%，and the lethal moisture content of 50% was 12.72%. （3） The relative conductivity，the contents of soluble sugar and proline were increased gradually with the deepening of seed dehydration. The content of malondialdehyde （MDA） changed little when the dehydration rate was less than 24%，and increased significantly when exceeding 24%. Both activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） showed a trend of fluctuation and peaked at dehydration rate 18%. （4） Seeds with desiccation storage for one month at room temperature，and all the seeds with storage in damp sand at -1 ℃ and -20 ℃ for one month could not germinate. GP of seeds with water immersion for one month dropped significantly. Germination processes of seeds with storage in damp sand for one month，three months or six months at 4 ℃ were delayed，but there was no significant effect on GP. It indicates that when the dehydration rate of G. paucinervis is less than 18%，seeds can regulate resistance to maintain normal metabolism of cells. The seeds can endure a certain degree of dehydration and low temperature. When the dehydration rate exceeds 18%，the metabolism of seeds is unba-lanced，and then deteriorated until death，which belong to minimally recalcitrant seeds. It also indicates that storage in damp sand at 4 ℃ （moisture content 7.5%） is a good method for short-term storage of G. paucinervis seeds.

Key words：moisture content of seeds，?germination percentage，?dehydration sensitivity，?recalcitrant seeds，seed storage

了解植物種子的貯藏特性對植物種質資源保存、引種及遷地保護至關重要（Costa et al.，2018;Wyse et al.，2017）。Roberts（1973）根據種子的貯藏行為將種子分為頑拗性（recalcitrant）種子與正常性（orthodox）種子。頑拗性種子在脫離母株時沒經歷成熟脫水，其含水量通常高達30%～60%，對脫水和低溫敏感，干燥至含水量為15%～20%時大多死亡，在室溫通風條件下其貯藏壽命只有數天至數周，不能像正常性種子一樣進行干燥或低溫貯藏（Berjak & Pammenter，2001）。因此，頑拗性種子的貯藏條件不易掌控，需保證其含水量高于臨界含水量（critical moisture content，CMC）。此外，Ellis et al.（1990）把介于正常性和頑拗性之間的種子定義為中間性（intermediate）種子，其在含水量降低至7%～12%時受到傷害。產中間性種子的植物若起源于熱帶，則該種子對低溫敏感（Hong & Eliis，1996）。

頑拗性種子脫水過程中活力下降的主要原因是膜脂過氧化作用導致膜結構與功能被破壞，抗氧化保護系統活性下降和自由基的積累，致使細胞代謝紊亂（Greggains et al.，2001;Varghese et al.，2011）。全球氣候變化將對產頑拗性種子的植物生存造成一定威脅，因此頑拗性種子的脫水敏感性及儲藏一直是研究熱點。Pelissari et al.（2018）對巴西的66個樹種種子脫水耐性的研究表明頑拗性種子脫水耐性的評估可從胚和胚乳、種皮和果皮的含水量著手。藤黃屬的熱帶植物Garcinia gummi-gutta種子萌發緩慢，在含水量低于34%時萌發率大幅下降，于-10 ℃或5 ℃下貯藏2個月即完全失活，為熱帶休眠頑拗性種子，其在密閉的塑料箱中于15 ℃下貯藏18個月仍有90%的萌發率（Joshi et al.，2017）。此外，藤黃屬其他植物如G. indica、G. xanthochymus等的種子也具有脫水敏感性。貯藏頑拗性種子的原則是在種子所能承受的最低溫度下維持其含水量和活力，并防止微生物侵害（Berjak & Pammenter，2007）。布迪椰子（Butia capitata）種子在冷凍狀態下保存易失去活力，但其分離出的胚可保存于超低溫液氮中（Dias et al.，2015）。

金絲李（Garcinia paucinervis）系藤黃科（Guttiferae）藤黃屬（Garcinia）常綠喬木，屬國家二級重點保護植物和瀕危級植物（Farm et al.，2003），為喀斯特山體特有珍貴樹種，分布于廣西西部、西南部和云南東南部海拔194～830 m的巖溶山林中（張俊杰等，2017），是集觀賞價值、生態價值、藥用價值和經濟價值為一體的優良樹種（Zhang et al.，2015a）。日前，該物種野生種群分布點有限且分散，大樹及能結實的植株極少，天然更新困難（張俊杰等，2017）。近年來，喀斯特地貌生境的惡化已制約著喀斯特地區社會經濟的發展。金絲李作為該地區優良生態修復樹種，日前人工栽培較少，且鮮有關于其人工繁殖的報道。據作者前期研究發現，金絲李枝條扦插難以成活，其種子具休眠特性（張俊杰等，2018），在通風處存放1個月后便干癟，生活力隨之喪失，種子貯藏問題十分棘手，其苗木繁育極大受限。因此，該文通過開展金絲李種子不同脫水程度的萌發情況及其復水后的吸水率、脫水過程中抗性生理指標的變化、不同貯藏方式下種子的萌發情況等研究，探明其脫水敏感性程度并找出科學貯藏方法，為金絲李的保育和利用提供科學指導。

1?材料與方法

1.1 材料

金絲李種子于2016年6月采自弄崗國家級自然保護區（106°57′18″ E，22°27′58″ N）。果實采收后帶回實驗室堆漚10 d左右，搓洗掉果皮果肉并洗凈種子，晾干表面水分以備用。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 種子基本特征及含水量測定?采用百粒法測量種子千粒重，隨機抽取50粒飽滿種子，測量其二維尺度。以TTC法測定新鮮種子的生活力（宋松泉等，2005）。隨機取3粒新鮮種子，切成1 mm薄片，（105±2）℃烘17 h后，以鮮重為基礎計算種子含水量（ISTA，1999），5次重復。

1.2.2 材料的脫水處理?將種子于分析天平上稱量其原重量W1，隨即放在室內通風處（26～31 ℃，72%～82%RH）自然脫水，定期稱其重量W2，計算失水率：失水率=（W1-W2）/ W1×100%，控制種子的失水率在6%、12%、18%、24%、30%、36%和42%共7個含水量梯度（允許0.3%以內的誤差）。將部分新鮮（即初始含水量）種子和不同失水率的種子用液氮冷凍保存于-80 ℃冰箱內，用于抗性生理指標測定。

1.2.3 脫水種子復水后吸水率的測定?以新鮮種子為對照，將失水率為6%、12%、18%、24%、36%和42%的種子浸泡于蒸餾水中，置于25 ℃恒溫培養箱中自然復水吸脹，每1天稱重1次并換水，當種子吸水達到飽和時記錄其重量W3，結合種子原重量W1計算脫水種子復水后的吸水率：吸水率=（W3-W1）/ W1×100%，各重復3次，并統計各脫水梯度種子吸水達到飽和所需的時間（以下簡稱吸水飽和時間）。

1.2.4 脫水種子萌發試驗與萌發參數的計算?將1.2.2中7個不同脫水程度的種子以新鮮種子為對照進行萌發試驗。播種前種子經0.1%的K2MnO4溶液消毒30 min，清水洗凈。試驗容器為容量為1 000 mL、172 mm × 117 mm × 70 mm的塑料盒，鋪以4 cm厚經消毒的河沙為基質，播種深度為1 cm，每梯度2盒，每盒播10粒，3次重復，放入設定為25 ℃、周期性光照（3 000 lx，12 h·d-1）的LRH-250-G光照培養箱，適時添加蒸餾水保持基質濕潤。萌發試驗時長為448 d，以芽頂出沙層為種子萌發標準，觀察到第1粒萌發的種子后，每7天統計1次萌發的種子數。根據種子萌發情況計算以下指標：萌發時滯（germination time lag，GTL）、萌發率（germination percentage，GP）和平均萌發時間（mean germination time，MGT），計算方法如下：

GTL（d）：即萌發啟動時間，指從萌發試驗開始至第1粒種子開始萌發所用時間;

GP=萌發種子數/播種種子數×100%;

MGT = ∑（ti×ni）/∑ni。

式中，ti為播種之日開始的第i天，ni為播種后第i天萌發的種子數（Liu et al.，2005）。

1.2.5 脫水種子抗性生理指標的測定?取失水率為6%、12%、18%、24%、36%和42%的種子，用解剖刀剝去種皮。以新鮮種子為對照，用電導儀法測定脫水種子胚和胚乳的相對電導率（Chai et al.，2018）;用氮藍四唑（NBT）法和愈創木酚法分別測定其超氧化物歧化酶（superoxide ismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性;用硫代巴比妥酸（TBA）法、蒽酮比色法和磺基水楊酸法分別測定其丙二醛（malondialdehyde，MDA）、可溶性糖和脯氨酸含量（李合生等，2000），各重復3次。

1.2.6 種子貯藏試驗?將新鮮種子按以下8種方法進行貯藏：（1）室溫干藏1個月;（2）4 ℃干藏1個月，種子裝入牛皮紙袋保存于4 ℃冰箱;（3）水浸貯藏1個月，將種子置于燒杯中，加蒸餾水沒過種子，置于25 ℃培養箱內，每天換水1次;（4）-20 ℃濕藏（將種子與含水量約7.5%的河沙按體積比1∶3混勻，下同）1個月;（5）-1 ℃濕藏1個月;（6）4 ℃濕藏1個月;（7）4 ℃濕藏3個月;（8）4 ℃濕藏6個月。將種子貯藏后按照1.2.4進行萌發試驗，試驗時長設定為350 d。

1.3 數據分析

用Microsoft Excel 2010軟件統計數據并作表，采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，Duncan法進行數據差異比較（將萌發率擬進行平方根反正弦轉換，使之方差齊性）。統計值以平均值±標準誤（x±sx）表示。以SigmaPlot 11.0軟件繪圖。

2?結果與分析

2.1 金絲李種子的大小及含水量

金絲李種子卵形至寬卵形，胚包裹于胚乳層中，不易與胚乳分離。種子長（30.80±2.14）mm，直徑（15.39±0.96）mm，千粒重（438 1.75±77.53）g。成熟種子的初始含水量為（45.29±0.72）%，種子生活力達（95.56±1.92）%。

2.2 室溫儲藏對種子脫水的影響

種子脫水的持續時間與失水率關系見圖1，隨著自然風干時間的增加種子均勻地脫水，當種子失水35 d之后，失水率在45%左右趨于平穩。

2.3 不同脫水程度種子復水后的吸水情況

金絲李種子的吸水過程十分緩慢，新鮮種子吸水飽和時間約為24 d，吸水率為14.55%。當種子失水率低于18%時，其飽和吸水率及吸水飽和時間與新鮮種子相比差異不顯著。隨著種子脫水程度的加深，其飽和吸水率與吸水飽和時間逐漸降低，失水率為42%的種子復水約12 d即達到飽和狀態，此時的吸水率為-6.69%，表明失水率為42%的種子復水后已經恢復不到原來新鮮種子的重量（圖2）。

2.4 脫水處理對種子萌發的影響

失水率為42%的金絲李種子萌發率為0。各脫水程度的種子萌發動態與萌發參數見圖3和表1，未萌發的種子已完全腐爛。失水率36%的種子萌發率始終低于其他脫水程度的種子。如表1所示，脫水處理的種子GTL隨著種子脫水程度的增加而逐漸延長。新鮮種子的GP為93.33%，當種子失水率低于18%時，GP沒有顯著變化;失水率超過18%時，GP下降較快，與對照差異均達顯著水平。當種子脫水超過臨界含水量（CMC）時種子活力大幅下降（Probert & Brierley，1989;Pammenter et al.，1998），以新鮮種子含水量為45.29%計，可知

金絲李種子的CMC為27.29%。當種子失水率為36%時，其GP僅為21.67%。而平均萌發時間隨著脫水程度的加深呈波動性變化，失水率為12%時MGT已顯著延長至242.88 d，在失水率為18%～24%時與對照無顯著性差異，但失水率為36%時MGT又大幅延長至337.33 d。

種子萌發率低至新鮮種子萌發率一半時的含水量稱為“半致死含水量（lethal moisture content of 50%，LMC50）”（何惠英和宋松泉，2003）。以新鮮種子萌發率和含水量分別為93.33%和45.29%計。由圖4可知，金絲李種子的LMC50為12.72%。由圖1可知，室內自然干燥約19 d即達到種子的半致死含水量。

2.5 種子脫水過程中抗性生理指標的變化

由新鮮金絲李種子脫水至失水率為42%時，相對電導率由52.03%直線上升至98.24%。由新鮮種子脫水至失水率為18%時，胚和胚乳的丙二醛含量上升了34.43%，差異不顯著;而種子由失水率18%上升至42%時，MDA含量顯著提高了

187.92%（圖5：A）。

隨著種子脫水程度的增加，SOD和POD活性均呈波動性變化趨勢（圖5：B）。失水率為18%時SOD與POD活性均達脫水過程的最高值;當種子失水率超過24%時，SOD與POD活性顯著下降;失水率達42%時，活性均有所回升。

種子的可溶性糖含量在失水率低于6%時保持平穩，之后呈直線上升趨勢，失水率為42%時可溶性糖含量是新鮮種子的3.03倍。隨著種子脫水程度的增加，脯氨酸含量呈逐步上升趨勢，失水率為42%時脯氨酸含量比新鮮種子顯著增加了7.10倍（圖5：C）。

2.6 貯藏方法對金絲李種子萌發的影響

室溫干藏1個月的種子和-1、-20 ℃濕藏1個月的種子至試驗結束后均完全腐爛。其余貯藏方法金絲李種子的萌發進程和萌發參數如圖6和表2所示。最終GP顯示，除WI1的種子GP顯著低于對照外，其余4種貯藏方式與對照比均無顯著差異。除DS1的GTL顯著長于對照外，其余貯藏方式的GTL與對照相比無顯著性差異。對于MGT、DS1和WI1與對照相比差異不顯著，而SH1、SH3和SH6處理均顯著延緩了種子萌發，即4 ℃濕藏延緩了金絲李種子萌發，但對GP影響不大。

3?討論與結論

金絲李種子大而重且含水量高，形態上表現出頑拗性種子的特征。在種子失水率低于18%時，其飽和吸水率、吸水飽和時間與新鮮種子差異不顯著，當失水率超過18%時，兩個指標均急劇下降，失水率為42%的種子復水后已恢復不到種子原重。可能是種子在脫水程度較低時，可通過吸漲作用修復在脫水時膜結構與酶的改變，但種子在高度脫水時，結構蛋白質與酶發生了不可逆轉的改變，吸漲作用減弱導致吸水量降低，種子逐漸失活。

金絲李種子在失水率低于18%時GP趨于平穩，失水率超過18%后GP急劇下降，說明輕度的脫水對種子萌發影響不大，但高度脫水則顯著降低其萌發率。相關性分析表明金絲李種子失水率與萌發率呈極顯著負相關（P<0.01），說明其對脫水敏感。因此在播種時，宜采用失水率低于18%，或夏季室溫通風放置不超過8 d的種子。金絲李種子萌發過程漫長，其GTL隨著種子脫水程度的加深而延長，可能是由于脫水后的種子生理修復需要時間。金絲李種子的MGT隨著脫水程度的加深呈現波動性變化的趨勢，這種現象在頑拗性的山血丹（Ardisia punctata）種子上也有體現（楊期和等，2013）。失水率在18%～24%時MGT與新鮮種子差異不大，可能與該含水量范圍內引起了種子內源激素含量或某些酶的活性變化有關。

相對電導率和MDA含量常用來衡量種子劣變和受傷害程度（Chen et al.，2016）。MDA是膜脂過氧化的終產物，脂質過氧化會損害細胞的膜系統，增大膜透性，造成代謝紊亂，且MDA會毒害細胞，降低SOD、POD等抗氧化保護酶的活性，使蛋白質的結構和功能發生變化（Ma et al.，2015），這是種子劣變的主要原因。活性氧（reactive oxygen species，ROS）能加速膜脂過氧化，傷害蛋白質和DNA（Farooq et al.，2009），種子在正常代謝受影響時會累積ROS，且種子的脫水耐性與其抗氧化防御系統有關。金絲李種子在脫水初期，種子水分逆境脅迫機制被激活，引發保護性反應，SOD、POD等酶的活性在種子脫水過程中逐漸增強以清除不斷產生的ROS，維持細胞膜的穩定性和完整性（Zhang et al.，2015b），所以相對電導率和MDA的增加均較緩慢;當種子失水率在18%～36%時，MDA含量的迅速上升表明膜脂過氧化加劇，MDA和ROS等有害物質的積累對細胞的毒害程度加深，超出了種子的耐受范圍，致使SOD和POD等酶的活性驟降，不能有效清除ROS（Tang，2012），伴隨著細胞膜透性增大、細胞內含物外滲，表現為相對電導率的急劇增加，種子的劣變加劇而逐漸失活。金絲李種子在失水率低于36%時，其相對電導率、MDA、SOD和POD 4個抗性生理指標與頑拗性的三七（Panax notoginseng）和板栗（Castanea mollissima）種子的整體變化趨勢一致（段銀妹等，2014; 宗梅等，2006）。但當種子失水率超過36%時，POD酶則參與了ROS的產生，對細胞產生毒害，或是與引起褐變的酚類物質和H2O2反應（楊淑慎和高俊鳳，2001），加速已受傷種子的劣變，造成細胞解體而死亡，這種情況在七葉樹（Aesculus chinensis）種子的脫水后期也有體現（陳淑芬，2006）。而脫水后期SOD升高的原因尚需進一步研究。可溶性糖能與LEA蛋白形成復合物協同控制脫水速度，脯氨酸則能穩定組織內的代謝及原生質膠體（李合生等，2000）。這兩種滲透調節物質可協助POD、SOD清除細胞體內多余的自由基，保護細胞免受傷害。金絲李種子隨著脫水程度的增加，可溶性糖、脯氨酸含量直線上升，積累溶質以降低滲透勢，維持細胞滲透平衡，說明其具有一定的滲透調節能力。結合上述分析可知，金絲李種子在失水率低于18%時，其萌發率和復水后的吸水情況與新鮮種子差異不顯著，種子可通過抗性調節維持細胞的正常代謝;當失水率超過18%時，種子代謝失衡而發生劣變直至死亡。

室溫干藏1個月與-1、-20 ℃濕藏1個月的金絲李種子不能萌發，4 ℃干藏下有少量種子干癟，說明其不宜干藏，對0 ℃以下低溫敏感。因其種子含水量高，直接貯藏于低于0 ?℃環境會引起細胞內結冰，凍融時破壞膜系統而誘發劣變。低于15 ℃的儲藏溫度對于大多數熱帶種子來說是致命的（Bedi & Basra，1993），如Garcinia gummi-gutta種子（Joshi et al.，2017）。而金絲李種子可在4 ℃濕藏6個月，雖然其GTL和MGT有所延長，但最終GP變化不大，說明4 ℃濕沙藏降低了種子貯藏過程中的新陳代謝，減緩水份散失，是短期貯藏金絲李種子的良好方法。水浸貯藏法可能由于部分種子缺氧或微生物感染壞死導致萌發率較低。

根據種子對脫水耐性和低溫敏感性的差異，將頑拗性種子分為高度、中度和低度頑拗性3種類型（Ntuli et al.，2015）。通常溫帶與熱帶地區的頑拗性種子相比，其耐脫水和低溫能力要強（Pammenter & Berjak，2000）。金絲李生于熱帶向亞熱帶的氣候過渡帶，其種子能忍受一定程度的干燥脫水和0 ℃以上的低溫，其CMC為27.29%，LMC50為12.72%，低于0 ℃則種子死亡，其頑拗性程度低于產于北熱帶的同屬植物云樹（G. cowa，種子初始含水量為50.1%，CMC為39%，4 ℃貯藏1個月均死亡）（Liu et al.，2005），與低度頑拗性的板栗（Castanea mollissima）種子接近（自然干燥9 d的種子萌發率100%，干燥15 d萌發率為53.5%，可于0～2 ℃甚至-4 ℃下濕藏）（陶月良和朱誠，2004; 王貴禧等，1999），高于中間性的凹葉木蘭（Magnolia sargentiana）種子（CMC和LMC50分別為15.3%、5.3～7.1%）（唐安軍，2014）。因此，金絲李種子屬于低度的頑拗性種子。根據Baskin & Baskin（2005）對休眠種子的定義，未經處理的金絲李種子萌發啟動時間超過4周，其種子存在休眠。由于高含水量，頑拗性種子大多萌發迅速，被認為無休眠特性或胎生性（Tweddle et al.，2003）。但近年來，陸續有文獻報道某些頑拗性種子具有休眠特性（Jayasuriya et al.，2012;Joshi et al.，2017），本研究支持后者的觀點。

金絲李分布于桂西和滇東南石灰巖山林里，凋落物對種子的掩埋可保持種子的含水量，冬季的相對低溫為種子創造了天然的濕藏條件。石山上由于巖石裸露、土層薄而較干旱，其種子低度頑拗性的特點使之在短期輕度的干旱下保持較高的生活力。本研究結果可為金絲李這一珍貴資源的保育與利用奠定基礎，而金絲李種質的長期保存可否用離體胚的超低溫保存法，需后續探討。

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