鴿毛滴蟲分離培養及形態學觀察

陸雨楠 陳俊紅 陳羽 朱秋陽 曹彬彬 陳瑾 戴鼎震

摘要：在生產飼養中，鴿毛滴蟲感染鴿的情況較為普遍和嚴重，嚴重影響鴿的健康和經濟價值。該文提供一種分離培養鴿毛滴蟲并對其形態學進行觀察的有效方法，為更好地了解鴿毛滴蟲的形態和預防控制提供了理論支持。

關鍵詞：鴿毛滴蟲;體外培養;形態學;掃描電子顯微鏡

中圖分類號：S858.39 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.16.003

0 引言

鴿毛滴蟲病（Pigeon Canker）又稱口腔潰瘍，是鴿最常見的一種傳染性原蟲病[1-2]。鴿毛滴蟲屬原生動物門，鞭毛綱，動鞭亞綱，多鞭毛目，毛滴蟲科，毛滴蟲屬的禽毛滴蟲[3-4]。該病的傳染源主要為病鴿。患病的成年鴿可通過互相接吻或嗉囊哺育幼鴿，將鴿毛滴蟲直接傳遞給同伴或幼鴿。另外，鴿毛滴蟲還可通過污染的飼料、鴿巢墊料、傷口等途徑感染鴿群[5]。鴿毛滴蟲病主要造成鴿上消化道和嗉囊粘膜上出現黃色潰瘍狀結節，阻礙鴿的正常進食和呼吸，導致患病鴿饑餓死亡。成年鴿大多為帶蟲者，癥狀表現不明顯。幼鴿癥狀表現明顯，排出綠色粘液樣糞便、羽毛雜亂且無光澤、消瘦、呼吸聲加重等[6]。鴿毛滴蟲大多是與大腸桿菌、念球菌等混合感染，單獨感染鴿毛滴蟲的病例較少。隨著養鴿業的集約化發展，鴿毛滴蟲病也變成養鴿場的常見病。鴿毛滴蟲病因特殊的傳播方式，短期內不能將其消滅干凈，導致幼鴿發病率較高，對鴿養殖業造成了比較嚴重的危害[7]。然而，目前對鴿毛滴蟲形態學的研究相對于陰道毛滴蟲形態學的較少，為從根本上防治鴿毛滴蟲，對鴿毛滴蟲進行形態學的觀察具有重要意義。鴿毛滴蟲體外培養的應用對進行抗鴿毛滴蟲的體外藥敏試驗及鴿毛滴蟲形態學的研究提供了有利條件[8-9]。毛滴蟲對體外培養的要求比較高，與培養基的pH值、環境溫度、營養物質等因素密切相關，但培養成功后檢出率高。對鴿毛滴蟲進行了體外分離、純化培養，并測定鴿毛滴蟲的增殖密度。應用光學顯微鏡對染色后的蟲體進行形態觀察，并應用掃描電子顯微鏡更清晰的觀察鴿毛滴蟲的外表面結構，為更好了解鴿毛滴蟲的形態提供了資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養用鴿毛滴蟲樣品

采集自患毛滴蟲病的白羽王鴿的口腔及咽喉處的干酪樣沉著物。

1.1.2藥品與試劑

注射用硫酸鏈霉素（100萬IU）、注射用青霉素鉀（160萬IU）、瑞氏一吉姆薩染色液（濟南百博生物科技股份有限公司）、革蘭氏染色液（濟南百博生物科技股份有限公司）、L-半胱氨酸鹽酸鹽和標準小牛血清（鄭州益康生物工程有限公司）、鴿子血清、小牛血清、麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉、香柏油、3%戊二醛。

1.2方法

1.2.1肝浸湯培養基制備

取15g新鮮豬肝，先除去筋膜，再剪成米粒大小放入燒杯。加入100mL蒸餾水，放入冰箱保存24h。次日取出蒸煮30min。用紗布過濾取上清液，后加入0.5g氯化鈉、1g麥芽糖、0.2gL-半胱氨酸鹽酸鹽、最后加入2g蛋白胨直至溶解，再用濾紙過濾。將濾液加蒸餾水定容至100mL，調pH至6，裝入無菌玻璃瓶中，置于高溫高壓滅菌器內121℃，30min高溫高壓滅菌。冷卻后置于4℃冰箱保存。抽取16mL肝浸湯溶解2瓶注射用硫酸鏈霉素（100萬IU）和一瓶注射用青霉素鉀（160萬IU），待溶解均勻后裝于無菌玻璃瓶內放置于冰箱內4℃保存。取3.5mL的無菌肝浸湯于無菌試管中，加入0.5mL的雙抗溶液和1mL的鴿子血清，混勻后即可接種鴿毛滴蟲。

1.2.2鴿毛滴蟲分離鑒定

用無菌棉拭子采集鴿口腔樣本后，放于無菌試管中封閉保存帶回實驗室。將樣本接種于已制備好的毛滴蟲液體培養基，37℃恒溫箱靜置培養48h。培養48h后混勻培養物，取一滴涂片后用光學顯微鏡鏡檢，如能發現梨形或者橢圓形，有折光性，不斷運動的蟲體，可初步診斷為鴿毛滴蟲病[10]。

1.2.3鴿毛滴蟲純化培養

從采集的鴿毛滴蟲樣品中選擇蟲體活性狀態好，且細菌和真菌相對較少的樣品接種于5mL鴿毛滴蟲肝浸湯培養基內進行第1代傳代培養，每隔48h傳代一次，傳代至3代后，鴿毛滴蟲培養基中細菌和真菌基本被消滅，繼續每隔48h傳代，得到較單純的鴿毛滴蟲培養基。

1.2.4鴿毛滴蟲光學顯微鏡形態觀察

該試驗中，將純化傳代至第4代的鴿毛滴蟲培養基樣品取適量涂于載玻片上，用酒精燈加熱固定，經瑞氏一吉姆薩染色和革蘭氏染色后，按低倍鏡一高倍鏡的順序觀察涂片。

1.2.5掃描電子顯微鏡樣本制備

含有毛滴蟲的肝浸湯培養基800r/min，離心10min，取上清液。將上清液再次離心，3000r/min，離心10min。離心后舍棄上清液，收集蟲體，取沉淀物。用3%戊二醛4℃固定過夜，用掃描電子顯微鏡觀察鴿毛滴蟲的形態。

1.2.6鴿毛滴蟲生長曲線測定

本次試驗接種的樣本為傳代至第四代，且生長了48h的鴿毛滴蟲。用同一管的樣本接種了三管肝浸湯培養基用于計數。待接種后，每隔12h計數一次，直至蟲體全部死亡。并根據計數數據繪制鴿毛滴蟲的生長曲線。

1.2.7藥物作用下鴿毛滴蟲形態學變化觀察

以鴿毛滴蟲在體外培養基中的生長曲線為依據，該試驗將純化培養至第四代且生長至48h的蟲體應用于藥敏試驗，因為生長至48～60h的鴿毛滴蟲增殖快且活性最強，因此可以確保用藥后鴿毛滴蟲的生長穩定。該藥敏試驗以48h作為體外藥敏試驗的周期，以此避免由于時間過長鴿毛滴蟲正常死亡造成試驗誤差。

2 結果與分析

2.1鴿毛滴蟲活體形態學觀察結果

鴿毛滴蟲活蟲體呈橢圓形、圓形、或梨形，有折光性。光鏡下的活蟲體有的向左有或向前運動、有的呈旋轉運動或布朗運動[4]，蟲體運動迅速，活性非常強。見圖1。

2.2鴿毛滴蟲染色后的形態觀察結果

在1000倍油鏡下，經瑞氏-吉姆薩染色后的蟲體呈橢圓形或不規則形。蟲體原生質被染成淡藍色。細胞核呈橢圓形，且被染成紅色，并位于蟲體前端[4]。鞭毛呈暗紅色或黑色，暗視野下能清晰觀察到4根前鞭毛。軸柱顏色淺于原生質，且稍突出于蟲體后緣。一側可清晰觀察到波動膜外邊緣的輪廓，顏色比原生質稍淺（如圖2A）。經革蘭氏染色后的蟲體呈橢圓形或不規則形。蟲體原生質呈淡紅色，細胞核的顏色比原生質深。能觀察到呈黑色的4根鞭毛和波動膜邊緣輪廓。軸柱突出于蟲體后緣，呈淡紅色（如圖2B）。

2.3不同生長期鴿毛滴蟲的形態觀察結果

鴿毛滴蟲生長到60h進行吉姆薩染色后，著色明顯，暗視野下能觀察到鞭毛。軸柱突出于蟲體外，著色較原生質淡。蟲體細胞核著色較原生質深，蟲體輪廓清晰（圖3C）。極少數鴿毛滴蟲生長了120h后死亡，大多數鴿毛滴蟲在生長衰亡期死亡，少數在生長遲緩期、生長對數期及生長穩定期死亡。取接種鴿毛滴蟲樣本120h后的培養基，經吉姆薩染色后，細胞核著色明顯，多數蟲體的鞭毛脫落，蟲體胞膜破裂，形成空洞，原生質溢出，空洞擴大后，蟲體裂解形成碎片。死亡裂解后的鴿毛滴蟲著色較活的鴿毛滴蟲淡（圖3D）。

2.4鴿毛滴蟲掃描電子顯微鏡的形態觀察結果

鴿毛滴蟲呈卵圓形或球形。如圖4E所示，在掃描電子顯微鏡下，60h前活力較強，鴿毛滴蟲表面較為光滑，上面分布少許褶皺，可清晰的觀察到四條前鞭毛，這些鞭毛起源于蟲體前端毛基體的游離鞭毛。發育發達的波動膜起始于蟲體的前端，波動膜幾乎可以延伸到身體的整個長度。一根軸柱延伸出蟲體的后緣。后蟲體開始衰老，蟲體開始皺縮，表面粗糙（如圖4F所示）。繼而，鴿毛滴蟲表面皺縮加深，空洞變大，如圖4G所示，蟲體輪廓及鞭毛不清晰。在接近120h時，蟲體崩解（如圖4H所示）。

2.5鴿毛滴蟲生長曲線測定結果

對鴿毛滴蟲在肝浸湯培養基中的生長情況進行測定，結果如圖5所示：蟲體在肝浸湯培養基中生長良好，在接種了蟲體12h內鴿毛滴蟲增殖不太明顯;12～48h鴿毛滴蟲增殖明顯，蟲體數量緩慢增加;48～60h鴿毛滴蟲數量呈直線上升，蟲體呈對數增長;蟲體在60h左右，蟲體密度及活性最強;接種鴿毛滴蟲60h后，鴿毛滴蟲數量達最高峰，后則迅速下降;在接種后的第3天，鴿毛滴蟲平均數為97.07×10 5個/mL，蟲體數量最多;至84h時，顯微鏡視野下可見大量死亡蟲體;84h后蟲體緩慢死亡，直至120h，蟲體全部死亡。鴿毛滴蟲生長曲線見圖5。

3 討論

鴿毛滴蟲在外界環境中抵抗力低，鴿毛滴蟲對體外培養基有特殊的營養要求，需加血清才能生長及適量的兩性霉素才能存活。進行鴿毛滴蟲體外接種培養時，應在無菌條件下完成操作，避免細菌污染培養基，保證鴿毛滴蟲的純化培養。此次試驗還應用小牛血清培養鴿毛滴蟲，但是，培養了48h后取培養液進行顯微鏡觀察，發現此次用小牛血清培養的鴿毛滴蟲數量較少。所以試驗用的鴿毛滴蟲皆使用鴿子血清進行培養。用鴿子血清培養的毛滴蟲數量增加迅速，視野內蟲體運動迅速，活性非常強。從鴿毛滴蟲的生長曲線表明，用肝浸湯培養的鴿毛滴蟲接種后60h增殖達到高峰的活蟲體數比張靜靜等人報道的HF培養基中的鴿毛滴蟲的數量多。但是，肝浸湯培養容易產生肝雜質，在后期不利于蟲體的觀察和計數[10]。

此次試驗用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡分別觀察了鴿毛滴蟲的形態，在100倍光學顯微鏡下能觀察到有折光性、圓形或橢圓形，且快速游動的鴿毛滴蟲。在1000倍油鏡下，通過吉姆薩染色后能觀察到鴿毛滴蟲呈橢圓形或不規則形。蟲體原生質被染成淡藍色，橢圓形的細胞核呈紅色，暗視野下能清晰的觀察到4根不等的前鞭毛。在掃描電子顯微鏡下，正常的鴿毛滴蟲呈梨形或球形。鴿毛滴蟲表面出現褶皺或折痕。蟲體飽滿，各個外表面結構輪廓清晰，并可清晰觀察到4條前鞭毛。發育發達的波動膜幾乎可以延伸到蟲體的整個長度。

4 結論

試驗觀察到鴿毛滴蟲在肝浸湯培養基中生長繁殖過程，從接種到60h生長良好，可達生長高峰，蟲體飽滿，運動迅速，表面光滑，后呈下降趨勢，蟲體數量減少，死亡增多，蟲體呈萎縮、出現空洞，崩解，并在120h達到死亡底限。本試驗結果建立了可靠的鴿毛滴蟲培養方法，弄清了鴿毛滴蟲的生長規律，為檢測、分離鑒定以及篩選抗鴿毛滴蟲藥物提供了基礎。

參考文獻

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基金項目：江蘇省大學生創新訓練，省重點項目（201813573013Z）

作者簡介：陸雨楠（1997-），女，江蘇省南通人，碩士研究生，主要從事獸醫學研究。

通信作者：戴鼎震（1964-），男，江蘇興化人，博士，教授，主要從事預防獸醫學及中獸醫的研究。