孟德?tīng)栯S機(jī)化研究潰瘍性結(jié)腸炎與甲狀腺功能減退發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的因果關(guān)系

花胤 王曉燕 王振 辛永寧 劉守勝

1南京醫(yī)科大學(xué)青島臨床醫(yī)學(xué)院（青島市市立醫(yī)院）（山東青島 266011）；青島市市立醫(yī)院2國(guó)際門(mén)診，3感染性疾病科，4臨床研究中心（山東青島 266011）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病程反復(fù)的炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD），常由復(fù)雜的環(huán)境、免疫以及遺傳因素共同引起，其從結(jié)腸遠(yuǎn)端開(kāi)始發(fā)病并向近端擴(kuò)展直至全結(jié)腸［1］。作為一種免疫介導(dǎo)的炎癥性腸病，雖然UC主要影響消化道，但患者常出現(xiàn)腸道以外癥狀，包括肌肉骨骼、皮膚、眼部、肝膽、血液系統(tǒng)及內(nèi)分泌疾病等［2］。甲狀腺功能減退（hypothyroidism，HT）作為一種內(nèi)分泌疾病，常由一種自身免疫疾病橋本病引起，表現(xiàn)為免疫細(xì)胞攻擊甲狀腺，最終引起甲狀腺的功能喪失導(dǎo)致HT 的發(fā)生［3-5］。有研究［6-8］發(fā)現(xiàn)UC 患者發(fā)生甲狀腺疾病包括HT 的風(fēng)險(xiǎn)較正常個(gè)體更高。然而另外的研究［9］則發(fā)現(xiàn)IBD 患者與正常個(gè)體之間的HT 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯差異。近期的一項(xiàng)回顧性研究［10］發(fā)現(xiàn)，IBD 會(huì)降低患者發(fā)生HT 的風(fēng)險(xiǎn)，并不推薦IBD 患者在缺少臨床癥狀的情況下實(shí)施甲狀腺超聲檢查。因此，目前雖已有較多研究報(bào)道了UC 與HT 之間的關(guān)系［11］，但結(jié)論仍然具有爭(zhēng)議，并且既往研究大多是靠觀察性研究得到的關(guān)聯(lián)結(jié)論，可能受到某些混雜因素及反向因果關(guān)系的干擾。孟德?tīng)栯S機(jī)化（mendelian randomization，MR）作為一種疾病之間因果關(guān)系的推斷方法在遺傳病學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，MR 通過(guò)遺傳變異作為工具變量來(lái)推斷暴露變量能否影響結(jié)局，可以避免觀察性研究中可能出現(xiàn)的缺點(diǎn)。因此，本研究擬通過(guò)兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化（two sample mendelian randomization，TSMR）分析來(lái)確定UC 與HT 之間發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究原理 孟德?tīng)栯S機(jī)化的基本原理是通過(guò)工具變量來(lái)分析暴露與結(jié)局關(guān)聯(lián)的因果關(guān)系。其分析的準(zhǔn)確性需要滿足下述3 個(gè)核心假設(shè)：（1）關(guān)聯(lián)性假設(shè)：工具變量需要與暴露因素強(qiáng)相關(guān)；（2）排他性假設(shè)：工具變量只能通過(guò)暴露因素對(duì)結(jié)局產(chǎn)生影響；（3）獨(dú)立性假設(shè)：工具變量需要和結(jié)局及混雜因素沒(méi)有關(guān)聯(lián)［12］（圖1）。

圖1 孟德?tīng)栯S機(jī)化的3 個(gè)核心假設(shè)Fig.1 Key assumptions of Two-Sample MR Analysis

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源 通過(guò)搜索全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study，GWAS）。分別獲得UC 和HT 的GWAS 匯總數(shù)據(jù)，其中UC 樣本數(shù)據(jù)來(lái)自芬蘭生物銀行（https：//www.finngen.fi/fi），共計(jì)211 498個(gè)樣本（觀察組：1 198；對(duì)照組：210 300），共計(jì)16 380 453 個(gè)SNP 位點(diǎn)。HT 樣本數(shù)據(jù)來(lái)自IEU open GWAS（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/ebi-a-GCST90018862/），此數(shù)據(jù)庫(kù)樣本量為410 141（觀察組：30 155；對(duì)照組：379 986），共計(jì)24 138 872 個(gè)SNP 位點(diǎn)（表1）。

1.3 工具變量的篩選 根據(jù)以下條件篩選暴露的工具變量：（1）選取與暴露的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)水平（P＜ 5 × 10-8）的SNPs；（2）排除SNPs 之間的連鎖不平衡影響（linkage disequilibrium，LD），設(shè)置連鎖不平衡參數(shù)（r2）閾值為0.01，遺傳距離為1 000 kb，從而確保SNP的獨(dú)立性；（3）排除位于回文序列中的工具變量；（4）使用PhenoScanner數(shù)據(jù)庫(kù)剔除與混雜因素相關(guān)的遺傳工具變量，重點(diǎn)排除表型與結(jié)局有相關(guān)意義的SNP。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 分別采用逆方差加權(quán)法（inverse variance weighted，IVW）、Egger 回歸法（MR-Egger）、中位數(shù)加權(quán)法（weighted median）開(kāi)展TSMR，并采用森林圖（forest plot），散點(diǎn)圖（scatter plot）可視化上述方法的OR值（odds ratio）及95%CI（confidence interval）。IVW 法通過(guò)Wald估計(jì)值獲得加權(quán)平均值，是本研究的主要分析工具，其主要原理是將每個(gè)遺傳變異看作獨(dú)立的工具變量，并通過(guò)薈萃分析合并工具變量的因果效應(yīng)估值，當(dāng)所有的遺傳變異都是有效的工具變量時(shí)，IVW 法是因果效應(yīng)的最有效評(píng)價(jià)工具。MR-Egger 回歸法與IVW 法類似，但可以通過(guò)回歸截距評(píng)估工具變量的水平多效性。中位數(shù)加權(quán)法對(duì)因果效應(yīng)的評(píng)估最少只需要50%的有效工具變量，因此能在存在無(wú)效工具變量的情況下，提供穩(wěn)定的因果效應(yīng)值。關(guān)于敏感性分析，本研究利用MR-PRESSO（MR Pleiotropy Residual Sum and Outlier，MR-PRESSO）法評(píng)價(jià)是否存在離群的SNP 位點(diǎn)［13］，采用MREgger 的截距值評(píng)估水平多效性，采用Cochran′s Q檢測(cè)及漏斗圖（funnel test）評(píng)估SNPs 中的異質(zhì)性，采用留一法分析（leave one out）分析是否存在單個(gè)SNP 能夠影響因果評(píng)估的結(jié)果，以上統(tǒng)計(jì)分析均通過(guò)開(kāi)源軟件R（版本4.3.1）及R包“TwoSampleMR”（版本0.5.7）進(jìn)行。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 工具變量評(píng)價(jià) 工具變量的強(qiáng)度通過(guò)統(tǒng)計(jì)量F計(jì)算，其公式為F=R2× (N-k- 1)/(1 -R2) ×k。其中R2代表工具變量解釋的變異比例，N為暴露樣本的樣本量，k為工具變量的數(shù)量，而R2=(2 ×EAF×(1 -EAF) ×beta2)/(N×SE2)，EAF為次要等位基因頻率，beta為等位基因效應(yīng)值，SE為標(biāo)準(zhǔn)誤差［14］。

2 結(jié)果

2.1 UC 對(duì)HT 的MR 分析

2.1.1 遺傳工具變量確定 本研究選擇與UC 相關(guān)具有全基因組顯著性（P＜ 5 × 10-8）的遺傳變量SNP 位點(diǎn)進(jìn)行匯總，篩選出同時(shí)滿足假設(shè)1、2、3 的SNP，得到4 個(gè)符合假設(shè)的SNP。利用Pheno Scanner 數(shù)據(jù)庫(kù)去除與結(jié)局HT 具有相關(guān)意義的SNP（n= 0），通過(guò)GWAS 提取結(jié)局HT 的數(shù)據(jù)，獲取以上4 個(gè)SNP 與結(jié)局的顯著關(guān)系。合并暴露與結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)集，并剔除了存在連鎖不平衡和回文結(jié)構(gòu)的SNP，最終共納入了4 個(gè)SNP 作為工具變量進(jìn)行MR 分析。

2.1.2 TSMR 研究結(jié)果 本研究的TSMR 結(jié)果提示UC 可降低HT 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。IVW 法提供了主要的因果證據(jù)（OR= 0.957，95%CI：0.924 ～ 0.990，SE= 0.017，P＜ 0.05），三種MR 統(tǒng)計(jì)方法的結(jié)果見(jiàn)表2，MR-egger 法的結(jié)果（OR= 0.936，95%CI：0.924 ～ 0.990，SE= 0.032，P＞ 0.05）雖然不顯著但OR方向同樣支持IVW 法的結(jié)果。Weighted median法的結(jié)果（OR= 0.944，SE= 0.021，P＜ 0.001）其OR方向也支持了IVW 法的因果判斷。因此可知UC對(duì)HT 具有負(fù)向因果關(guān)系，TSMR 分析的散點(diǎn)圖和森林圖見(jiàn)圖2、3。

表2 TSMR 分析結(jié)果Tab.2 Results of the TSMR analysis

圖2 兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter Plot of Two-Sample MR Analysis

圖3 兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化森林圖Fig.3 Forest Plots of Two-Sample MR Analysis

2.1.3 敏感性分析 Cochran′s Q 檢驗(yàn)評(píng)估異質(zhì)性Q= 2.566，P= 0.463，表明納入的SNPs 無(wú)明顯異質(zhì)性，漏斗圖也進(jìn)一步驗(yàn)證了無(wú)異質(zhì)性的結(jié)果（圖4）。對(duì)于水平多效性，MR-Egger 法截距值為0.011 7（P= 0.523），表明納入的SNPs無(wú)明顯水平多效性，說(shuō)明工具變量并不通過(guò)暴露以外的途徑影響結(jié)局。MR-PRESSO 法未發(fā)現(xiàn)任何異常的SNP（P= 0.548）。留一法檢驗(yàn)顯示去除任意SNP 后結(jié)果仍然穩(wěn)定（圖5）。

圖4 兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化漏斗圖Fig.4 Funnel plot of Two-Sample MR Analysis

圖5 “留一法”敏感性分析結(jié)果Fig.5 The results of sensitivity analysis of “l(fā)eave-one-out”

2.1.4 工具變量評(píng)價(jià) 利用R2及F值的計(jì)算公式得出，其中4 個(gè)SNP 的統(tǒng)計(jì)量F值均＞ 10（31.07 ～65.43），表明本研究的工具變量均為強(qiáng)工具變量。

2.2 HT 對(duì)UC 的反向因果分析

2.2.1 遺傳工具變量確定 同樣選擇與HT相關(guān)具有全基因組顯著性（P＜ 5 × 10-8）的遺傳變量SNP位點(diǎn)進(jìn)行匯總，篩選出同時(shí)滿足假設(shè)1、2、3 的SNP，得到70 個(gè)符合假設(shè)的SNP。利用PhenoScanner 數(shù)據(jù)庫(kù)去除與結(jié)局UC 具有相關(guān)意義的SNP（n= 0），通過(guò)GWAS 提取結(jié)局UC 的數(shù)據(jù)，獲取以上70 個(gè)SNP 與結(jié)局的顯著關(guān)系。合并暴露與結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)集，并剔除了2 個(gè)存在回文結(jié)構(gòu)的SNP（rs2412976、rs2921053），并根據(jù)MR-PRESSO 結(jié)果剔除1 個(gè)離群的SNP（rs9271365），最終共納入了67 個(gè)SNP 作為工具變量進(jìn)行MR 分析。

2.2.2 TSMR 研究結(jié)果 本研究的TSMR 結(jié)果提示HT 對(duì)UC 不存在反向的因果關(guān)系。IVW 法（P=0.521），MR-Egger 法（P= 0.231），中位數(shù)加權(quán)法（P= 0.544）的結(jié)果均不提示存在顯著因果關(guān)系（P＞ 0.05）。

2.2.3 敏感性分析 同樣采用IVW 法評(píng)估異質(zhì)性Q= 78.831，P= 0.133，表明納入的SNPs 無(wú)明顯異質(zhì)性，漏斗圖也進(jìn)一步加強(qiáng)了無(wú)異質(zhì)性的結(jié)果。MR-Egger 法截距值為-0.014（P= 0.306），表明納入的SNPs 無(wú)明顯水平多效性，說(shuō)明工具變量并不通過(guò)暴露以外的途徑影響結(jié)局。此外留一法檢驗(yàn)示去除任意SNP 后結(jié)果仍然穩(wěn)定。

2.2.4 工具變量評(píng)價(jià) 反向因果關(guān)系統(tǒng)計(jì)量F均＞ 10（30.03 ～ 0523.14），都為強(qiáng)工具變量。

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)TSMR 評(píng)價(jià)了UC 和HT之間潛在的雙向因果關(guān)系。結(jié)果證實(shí)了UC 對(duì)HT的負(fù)向因果關(guān)系，表明并不推薦對(duì)無(wú)癥狀的UC 患者開(kāi)展額外的HT 檢查。此外我們識(shí)別了4 個(gè)聯(lián)系UC 與HT 的SNP 位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)有助于加深對(duì)UC 與HT 之間潛在的病理機(jī)制理解。

在UC 對(duì)HT 的MR 分析結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，MREgger 法得到了與另兩種方法不一致的結(jié)果。有研究認(rèn)為MR-Egger 法只能用作來(lái)評(píng)估工具變量的敏感性分析，而不能代替IVW 法的結(jié)果，并且本研究的質(zhì)量評(píng)估中，工具變量并不存在異質(zhì)性和水平多效性［15］。所以盡管MR-egger 法存在不一致的結(jié)果，我們?nèi)匀慌袛嘣赨C 和HT 之間存在負(fù)向的因果關(guān)系。

既往的觀察性研究［7-8，10，16-20］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些UC 和HT 之間的關(guān)系。DORE 等［10］在一項(xiàng)回顧性病例對(duì)照研究指出，UC 患者與健康個(gè)體相比患有HT 的風(fēng)險(xiǎn)更低（OR=0.33；95%CI：0.17 ～ 0.66）。RICART 等［19］也發(fā)現(xiàn)IBD 患者患有自身免疫性甲狀腺疾病的風(fēng)險(xiǎn)較低。此外POORAN 等［20］在一項(xiàng)橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，同屬于IBD 的克羅恩病患者發(fā)生甲亢的風(fēng)險(xiǎn)與正常個(gè)體相似，但HT 的風(fēng)險(xiǎn)更低。這些研究的結(jié)果與我們的孟德?tīng)柗治鼋Y(jié)果一致，即UC 患者與HT 之間存在負(fù)向因果關(guān)系。雖然也有一些文獻(xiàn)指出UC 會(huì)增加HT 的風(fēng)險(xiǎn)，例如KAPPELMAN 等［7］的研究中發(fā)現(xiàn)兒童UC 患者發(fā)生HT 的風(fēng)險(xiǎn)更高，MAHMOUD 等［8］發(fā)現(xiàn)IBD 患者中患有HT 的頻率更高。但是BAR YEHUDA 等［21］2019 年發(fā)表的一項(xiàng)納入12 625 例IBD 患者的IBD與自身免疫性疾病的研究表明，IBD 患者與大部分自身免疫性疾病相關(guān)如：風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性哮喘、銀屑病等，但這其中并不包括甲狀腺疾病。針對(duì)本研究UC 對(duì)HT 負(fù)向的因果關(guān)系解釋，有研究指出針對(duì)IBD 的免疫抑制治療可能抑制了自身免疫性HT 的產(chǎn)生，PASCHOU 等［22］發(fā)現(xiàn)IBD患者經(jīng)過(guò)抗腫瘤壞死因子（anti-TNF）如阿達(dá)利姆單抗（adalimumab），英夫利昔單抗（infliximab）治療后，與一般治療法相比甲狀腺自身抗體呈下降趨勢(shì)。

本研究的優(yōu)勢(shì)主要在于首次運(yùn)用了孟德?tīng)栯S機(jī)化法研究了UC 與HT 之間的因果關(guān)系，并且我們還進(jìn)行了反向TSMR 分析，以驗(yàn)證可能的反向因果關(guān)系。但是在我們的研究中仍然存在一些局限性。第一，本研究的選用的數(shù)據(jù)集是匯總類型的數(shù)據(jù)，無(wú)法通過(guò)年齡分層或者性別來(lái)進(jìn)行亞組分析。第二，數(shù)據(jù)樣本集包括了歐洲人群，這限制了對(duì)非歐洲人群的應(yīng)用。需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證對(duì)非歐洲人群的適用性。第三，本研究只納入了4 個(gè)工具變量，雖然都為強(qiáng)工具變量，但存在工具偏倚的可能，因此需要謹(jǐn)慎地解釋研究結(jié)果。在未來(lái)的研究中，可納入更多的遺傳標(biāo)記作為工具變量，并進(jìn)一步探索環(huán)境和生活方式因素對(duì)UC與HT 之間的因果關(guān)系，以及多種混雜因素對(duì)UC與HT 之間因果關(guān)系的影響。

【Author contributions】HUA Yin and WANG Zhen participated in the planning process and wrote the manuscript draft.WANG Xiaoyan performed the data analyses.XIN Yongning and LIU Shousheng interpreted the results of the data analyses and approved the final manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.