雜交水稻骨干親本Wx基因第一內含子+1位堿基多態性分析

連玲 潘麗燕 朱永生 許惠濱 鄭燕梅 何煒 羅曦 王穎妲 蔡秋華 謝華安 張建福

摘要：[目的]直鏈淀粉含量是影響稻米品質的重要因素，而編碼顆粒結合型淀粉合成酶（granule-boundstarchsynthetase，GBSS）的蠟質基因（Wx）是影響直鏈淀粉含量的主效基因。本研究擬分析120份雜交水稻親本的Wx基因第一內含子+1位堿基的多態性，以期研究其對內含子的剪接效率及Wx的表達的影響，為親本育種篩選提供理論參考。[方法]選取120份水稻親本材料，采用CTAB法提取基因組DNA，并以此為模版PCR擴增Wx基因片段;采用限制性內切酶AccI對PCR產物進行酶切分析，根據瓊脂糖電泳結果分析Wx基因第一內含子+1位堿基類型;同時測定其中19份親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值。[結果]PCR擴增結果顯示所有材料中均可擴增出清晰且單一的目的條帶;PCR產物的AccI酶切分析結果顯示，其中81份親本的Wx基因第一內含子+1位堿基是T，即為T型，占總數的67.5%，38份親本為G型，占總數的31.67%，而僅有1份親本為雜合型，即GT型，占總數的0.83%。19份親本的直鏈淀粉含量測定結果表明，7份G型親本的直鏈淀粉含量比12份T型親本的高，且其中6個G型親本的直鏈淀粉含量平均值均超過20%。另外，測定結果表明T型親本和G型親本的膠稠度和堿消值差別不明顯。[結論]120份雜交水稻骨干親本的Wx基因第一內含子+1位堿基類型測定結果表明，與T型親本相比，G型親本的直鏈淀粉含量明顯較高，而膠稠度和堿消值沒有明顯差別。

關鍵詞：Wx基因;第一內含子;堿基多態性;直鏈淀粉含量

中圖分類號：S511文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1355-09

0 引言

[研究意義]隨著人們對稻米品質要求的提高，水稻育種在注重提高產量的同時也越來越重視稻米品質的改良。直鏈淀粉含量是稻米食用和蒸煮加工品質的重要影響因素，稻米中直鏈淀粉含量高使得米飯硬、口感差，而其含量太低則導致米飯太軟黏結，口感也不好，因此適中的直鏈淀粉含量是優質米的重要指標。稻米中直鏈淀粉含量主要由Wx基因編碼的顆粒結合型淀粉合成酶（GBSS）所決定，而Wx的表達量與該基因第一內含子+1位堿基類型直接相關。因此，對Wx基因序列進行相關分析可為提高稻米品質育種效率提供必要的理論參考。

[前人研究進展]Wx基因位于6號染色體，Wang等克隆獲得了水稻Wx基因，全長5499bp，包括5’及3'非翻譯區、13個內含子和14個外顯子;蛋白編碼區CDS全長1830bp，編碼609個氨基酸。Wx基因的表達與直鏈淀粉含量密切相關，將反義Wx基因導入秈稻保持系岡4B和II-32B，結果顯示純合轉基因成熟種子中直鏈淀粉含量均有不同程度降低;陳剛等將反義Wx基因導入武運粳7號，發現轉基因植株穎果中Wx蛋白減少，顆粒結合型淀粉合成酶活性明顯下降，直鏈淀粉含量下降，總淀粉含量也顯著降低。研究表明Wx基因的第一內含子剪切效率與第一內含子+1的堿基直接相關，當Wx基因第一內含子+1位堿基為G時，即為等位基因Wx，能夠正常剪接，產生較多大小為2.3kb的Wx基因成熟mRNA進而翻譯成Wx蛋白，即GBSS，從而使得稻米中直鏈淀粉含量較高;而當Wx基因第一內含子+1位堿基為T時，即為等位基因Wx，無法正常剪接，產生保留1kb第一內含子的大小為3.3kb的mRNA前體，Wx蛋白翻譯受阻，GBSS量少，使得稻米中直鏈淀粉含量較低。對于Wx基因第一內含子+1位堿基類型的鑒定，研究發現當Wx基因第一內含子+1位堿基是G時，它與前后的堿基構成限制性內切酶AceI的識別位點，使相應的擴增片段能被AceI酶切;而當Wx基因第一內含子+1位堿基是T時，相應的擴增片段不能被AceI酶切。因此可以對相應片段進行擴增并采用Ace I酶切后，通過電泳條帶判斷出Wx基因第一內含子+1位堿基類型。另外，研究發現Wx基因序列中第一內含子剪切位點上游55bp處有（CT）n微衛星序列即串聯重復序列，對不同品種的相關序列進行分析，已發現的（CT）n包括（CT）20、（CT）19、（CT）18、（CT）17、（CT）14、（CT）13、（CT）11、（CT）10和（CT）8，（CT）n的多態性與直鏈淀粉含量直接相關;一般高直鏈淀粉含量品種含有（CT）重復次數少，即n≤14的Wx等位基因，低或中等直鏈淀粉含量品種含有重復次數較多，即n≥16的Wx等位基因，同時在（CT）n下游182bp處存在同樣與直鏈淀粉含量相關的（AATT）n重復序列，含有（AATT）6等位基因的品種直鏈淀粉含量較高，而含有重復次數少的（AATT）5等位基因的品種直鏈淀粉含量較低，但是這2個串聯重復序列的直接功能還不太清楚。[本研究切人點]雖然蔡秀玲等采用PCR-AccI分子標記檢測法檢測了63個栽培品種Wx基因第一內含子+l位堿基類型，但目前仍有許多品種的Wx基因第一內含子+1位堿基類型有待進一步分析，尤其是生產上常用親本材料。分析應用于育種的水稻親本材料的Wx基因第一內含子+1位堿基，可為相關育種提供理論依據。[擬解決的關鍵問題]本研究對120份水稻親本材料的Wx基因第一內含子+1位堿基進行分析，分析獲得120份親本材料的Wx基因第一內含子+1位堿基類型，測定其中部分材料的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值，并分析與Wx基因第一內含子+1位堿基類型的相關性，為水稻高品質育種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料及試劑

120份親本種子，由福建省農業科學院水稻研究所、農業部華南雜交水稻種質創新與分子育種重點實驗室保存。室內浸種、催芽，生長一周后取整植株，用于提取基因組DNA。

rTaq DNA聚合酶和Ace I限制性內切酶均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA，具體步驟如下：取0.1g左右的水稻植株裝進2mL eppendorf管中，在液氮中迅速磨成粉末狀;加入800uL 65℃預熱的CTAB提取緩沖液，65℃溫浴30min（隔5min左右翻動1次，使樣品受熱均勻）;取出2mLeppendorf管，冷卻后加入800ul氯仿：異戊醇（24：1），混勻后10000r-min離心10min，取出后吸取上清至新的1.5mL eppendorf管中;加入2/3上清體積的冰異丙醇，混勻后置-20℃冰箱中靜置30mm.;10000r·min離心5min，棄去上清;加入500ul75%的乙醇洗滌2次，置超凈工作臺吹干;加入200uL TE buffer（或無菌雙蒸水），溶解DNA。上述提取的DNA保存于-20℃，備用。

1.2.2PCR擴增PCR擴增所用上游引物Wx F 5’CTTTGTCTATCTCAAGACAC 3’，下游引物Wx R5’TTTCCAGCCCAACACCTTAC 3。

以上述提取的DNA為模板進行PCR擴增，每個樣品做3次重復，反應體系為：rTaq Buffer l uL，dNTP（2.5mmol·L）0.8uL，上游引物WxF（10umol-L）0.4uL，下游引物WxR（10pmol'L）0.4uL，DNA模板1uL，rTaq 0.1uL，ddHO補足至10uL。PCR擴增程序為：94℃預變性5min后，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃30s，30個循環，72℃延伸7min。反應完成后，取4uL PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。為了進一步驗證試驗的準確性，選其中7個樣品送測序，進行序列分析。

1.2.3AccI酶切分析取上述PCR產物，進一步進行酶切分析，反應體系為：10×M buffer 1uL，PCR產物3uL，Acc 10.5uL，ddHO補足至10uL，37℃酶切5h;取5uL酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4米質分析從120份親本材料中隨機選取19份材料，種植于福建省三明市沙縣夏茂基地。收獲成熟種子，自然曬干，每個品種稱取200g，采用中華人民共和國農業農村部標準米質測定方法NY/T83-2017，對樣品的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值進行測定，每個品種測3次重復。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

以基因組DNA為模版進行PCR擴增，瓊脂糖電泳結果顯示，樣品中均可擴增出清晰且單一的目的條帶（圖1-A），所擴增出的Wx基因片段大小為253bp（圖1-B），矩形框所示為Wx基因第一內含子+1位，即堿基出現多態的位點。

2.2AccI酶切結果

采用限制性內切酶AccI對PCR產物進行酶切，瓊脂糖電泳結果表明酶切后出現3種帶型，第一種是只有約120bp的1條帶（圖2-A第一泳道），即Wx基因第一內含子+1位堿基為G時，形成限制性內切酶Ace I識別位點_QTATAC（圖2-B），253bp的Wx基因片段均被切成126bp和127bp 2個片段，由于這2個片段大小只差1個堿基所以電泳顯示在同一個位置，這種類型記為G型。第二種還是253bp一條帶（圖2-A第三泳道），與圖1-A顯示的條帶相同，即Wx基因第一內含子+1位堿基為T時（圖2-B），253bp的Wx基因片段無法被AccI酶切，這種類型記為T型。第三種是出現2條帶（圖2-A第二泳道），一條為沒有被AccI酶切動的253bp的條帶，一條為被AccI酶切動后呈120bp左右的一條帶，包含第一種和第二種2種帶型，即為雜合型，記為GT型。

2.3120份親本的Wx基因第一內含子+1位堿基類型分析

以本課題保存的120份水稻親本為材料，提取基因組DNA，進行PCR擴增Wx基因片段，并用限制性內切酶AceI進行酶切分析，瓊脂糖電泳結果顯示了120份親本的條帶類型（圖3）。根據2.2中的分類，對120份親本的Wx基因第一內含子+1位堿基類型進行分析（表1）。結果表明，120份親本材料中，81份為T型，占總數的67.5%，其中5個品種少蘗粳、空育131、臺農67、09NB352越光、臺灣粳稻為粳稻品種，其余為秈稻品種;38份為G型，占總數的31.67%，其中云引為粳稻，特青為秈偏粳，其余為秈稻品種;一個品種內江P164為GT型，占總數的0.83%。另外，將其中7個品種的PCR產物進行回收并送測序;序列分析結果顯示明恢86、明恢63、多系1號和閩恢3301的Wx基因第一內含子+1位堿基為T，功米3號、南恢397、廣恢128的Wx基因第一內含子+1位堿基為G（圖4），與酶切分析結果一致。

2.4 直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值與Wx基因第一內含子+1位堿基類型的相關分析

從120個親本中隨機選取19個親本，均為秈稻（特青為秈偏粳），其中12個親本的Wx基因第一內含子+1位堿基類型為T型，其余7個親本的為G型。對19個親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值進行測定，結果表明，Wx基因第一內含子+1位堿基類型為G型7個親本的直鏈淀粉含量比堿基類型為T型親本高;除了IR661的直鏈淀粉含量平均值為16.91%，其他6個G型親本的直鏈淀粉的含量平均值均超過20%，Nerica2品種的直鏈淀粉含量最高，平均值達到26.84%;而Wx基因第一內含子+1位堿基類型為T型的直鏈淀粉含量平均值均在20%以下，最高的為16.67%，而最低的為9.98%;對T型組和G型組親本的直鏈淀粉含量進行方差分析，差異極顯著。膠稠度的測定結果顯示，總體上看，Wx基因第一內含子+1位堿基類型為G型親本的膠稠度偏高一些，但T型組和G型組親本的膠稠度沒有顯著差異。另外，堿消值的測定結果顯示T型組和G型組親本之間并沒有存在明顯的規律性差別，方差分析顯示沒有顯著差異（表2）。以上結果表明，直鏈淀粉含量確實與Wx基因第一內含子+1位堿基類型存在直接的關系，即Wx蛋白的表達量與直鏈淀粉含量密切相關;而膠稠度和堿消值與其關系較小。

3討論與結論

對于稻米中直鏈淀粉含量性狀的改良，傳統育種方法是收取成熟的種子后測定直鏈淀粉的含量，這種做法周期長，效率不高，而且比較容易受環境條件的影響。而分子標記輔助選擇直接對基因型進行選擇，在苗期即可以進行，省時省力，大大提高了育種效率。

對于Wx基因第一內含子+1位堿基的鑒定，一種是PCR-AccI法;另一種是PCR一步法，即設計的引物3’末端堿基是基因第一內含子+1位堿基且為G，當模板DNA相應位置是C時，擴增產物在瓊脂糖電泳圖上清晰可見，而當相應位置是A時，擴增產物在瓊脂糖電泳圖上條帶模糊。因此，PCR一步法是根據PCR產物的電泳條帶亮度來判斷得出Wx基因第一內含子+l位堿基類型，這種方法雖然更快速，但是容易受PCR擴增效率的影響，比如實驗過程中因操作問題使得PCR擴增效率低，這樣即使相應位置是G電泳條帶也可能會比較淡，所以就會影響判斷結果。PCR-AccI法需要在PCR之后再進行酶切，然后再進行電泳，多了一個酶切步驟，但是不受PCR擴增效率的影響，準確率相對比較高。張士陸等采用直鏈淀粉含量低的親本對057進行回交改良，利用PCR-AccI分子標記輔助選擇Wx基因型，結合直鏈淀粉含量測定進行驗證，獲得了農藝性狀與057相似且直鏈淀粉降低的穩定株系。利用PCR-AccI進行輔助選育，經回交轉育將來自中等直鏈淀粉含量優質秈稻的Wx基因導入特青品種，選育了保持有特青主要農藝性狀且直鏈淀粉含量下調的優質品系;進一步用改良品系與培矮64S雜交，所得到的雜交組合具結實率高等優異農藝性狀且直鏈淀粉含量明顯改善。用優質的秈稻品種D香1B對綜合性狀優良但品質欠佳的G46B進行品質改良，利用PCR-Acc 1分子標記輔助選擇，獲得了直鏈淀粉含量中等的品系。另外，利用PCR-Acc I分子標記輔助選擇，將供體材料控制直鏈淀粉的Wx導入到不同恢復系中，篩選獲得了直鏈淀粉含量適中的恢復系材料;并將改良株系與廣占63S和Y58S配組，得到了農藝性狀沒有發生明顯改變且直鏈淀粉含量適中的組合。充分說明了利用PCR-Acc I分子標記輔助選擇是改良水稻品種直鏈淀粉含量的有效方法。本研究采用PCR-AccI法對120個親本材料的Wx基因第一內含子+1位堿基進行了分析，并且PCR擴增后全部樣品先進行電泳，以確保每個樣品均已擴增出明顯的目的條帶，后再進行酶切;另外，所用引物擴增出的片段，Acc I酶切位點在片段的中間，被AccI酶切后瓊脂糖電泳圖上只出現較小的一條帶，易與沒有被切動的條帶區分開，電泳效果好。

本研究對120個親本材料的Wx基因第一內含子+1位堿基進行了分析，并測定了其中19個親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值，分析說明了直鏈淀粉含量與Wx基因第一內含子+1位堿基類型直接相關，可為這些親本應用于米質改良育種提供必要的理論依據。