小粒種咖啡種質資源重要農藝性狀遺傳多樣性分析

閆林 陳婷 黃麗芳 李錦紅 馬關潤 王曉陽 董云萍 龍宇宙 李學俊

摘要：[目的]分析小粒種咖啡種質資源農藝性狀和品質性狀的多樣性，為小粒種咖啡品種選育提供科學依據。[方法]以60份小粒種咖啡種質資源為材料，進行8個農藝性狀和5個品質性狀測定，并采用相關性分析、主成分分析和聚類分析等方法進行多樣性分析。[結果]在8個農藝性狀中，變異系數以鮮干比最高（25.15%），其次為鮮果重（19.85%），以出米率最低（1.97%）;遺傳多樣性指數以種子長為最高（2.04）。在5個品質性狀中，變異系數以綠原酸最高（22.68%），其次為脂肪（12.40%），蛋白質為最低（5.20%）;遺傳多樣性指數以綠原酸最高（2.07），其次為脂肪（2.06）和蛋白質（2.05）。性狀相關性分析結果表明，干豆重與出米率呈顯著正相關，種子大小與百粒重、出米率、蛋白質呈極顯著正相關，百粒重與出米率、蛋白質、脂肪呈極顯著正相關，出米率與蛋白質、脂肪呈極顯著正相關，蛋白質與脂肪呈極顯著正相關，咖啡因與蔗糖呈極顯著負相關。主成分分析結果表明，前4個主成分因子（PCI、PC2、PC3、PC4）包含了12個農藝性狀，累計貢獻率達69.17%，表明這些性狀是造成小粒種咖啡種質多樣性的主要因素。聚類分析結果表明，60份小粒種咖啡種質可分為兩個大類群，第1類群有53份資源，第Ⅱ類群有7份資源。第Ⅱ類群的鮮果重大，尤其是II-2類群的鮮果重和干豆重。[結論]60份咖啡種質資源存在豐富的遺傳多樣性，可通過引種馴化、雜交、嫁接和分子育種等技術將其優異基因延續下去。第Ⅱ-2類種質的鮮果重和干豆重大，可作為選育和改良品種的基本材料。

關鍵詞：小粒種咖啡;農藝性狀;遺傳多樣性;相關性分析;主成分分析;聚類分析

中圖分類號：S571.2文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1379-09

0 引言

[研究意義]咖啡與可可、茶并稱為三大飲料作物，主要分布在拉丁美洲、亞洲及非洲等熱帶地區，2017年咖啡收獲面積1.09×10萬hm、產量921萬t。咖啡屬Coffea約有100多個種，生產栽培的主要有小粒種（Coffea arabica L）和中粒種（Coffeacanephora Pierre），小粒種約占總產量的60%、中粒種約占總產量的40%。我國引種咖啡已有100多年歷史，主要分布在云南、海南、四川、臺灣等地區，經過十多年的發展，目前已形成云南、四川小粒種咖啡優勢產區和海南中粒種咖啡優勢產區，2018年全國種植面積12萬hm，年產量17萬t、農業產值20多億元，是產區農民脫貧致富的主要經濟來源。然而，我國咖啡產業存在種植品種單一、品質較差和比較效益偏低等突出問題，加強優良咖啡品種選育勢在必行。因此，開展咖啡種質資源鑒定評價及遺傳多樣性研究，對咖啡優良品種的選育及咖啡產業發展均具有重要意義。[前人研究進展]我國收集保存了大量的咖啡種質資源并進行分析評價。周華等通過對其根、莖、葉、花、果等進行評價，明確了不同性狀的表型分類。白學慧等對96份咖啡種質抗銹病性狀進行了評價。一些學者采用基于DNA水平的各種分子標記技術對我國咖啡種質資源進行了遺傳多樣性分析，明確其親緣關系。植物表型性狀標記具有簡單、明顯和易于識別的特征，是進行種質資源鑒定和描述等研究最直接和最基本的方法和手段。聚類分析可揭示種質資源個體間的遺傳相似性，還能表明類群間的遺傳差異和相互間的親緣關系。主成分分析可揭示種質資源的生物學特點和生物學意義，能從多個因素指標中找出數量較少并能控制所有變量因子的主成分，其中每個主成分都能反映原始變量的大部分信息，且所含信息互不重復。聚類分析和主成分分析可為作物種質資源鑒定評價和分類提供參考依據，已在豌豆、陸地棉’、甜高粱等作物進行了相關研究。[本研究切入點]表型性狀鑒定是咖啡種質資源研究最基本的途徑，咖啡因、綠原酸、蛋白質、脂肪及蔗糖等主要生化成分是咖啡風味及營養價值的主要決定因素。雖然我國收集保存了大量的咖啡種質資源，但許多種質資源尚未充分鑒定評價與開發利用，因而加強咖啡種質資源鑒定評價是咖啡新品種選育研究的重要基礎工作。目前未見應用聚類分析及主成分分析方法對咖啡種質資源主要農藝性狀和品質性狀進行鑒定和分析評價的報道。[擬解決的關鍵問題]本研究以60份小粒種咖啡種質為試驗材料，測量其8個農藝性狀和5個品質性狀，采用相關性分析、主成分分析和聚類分析相結合的方法，綜合分析咖啡種質農藝性狀和品質性狀的遺傳多樣性，以期篩選優良種質或發掘咖啡資源的優異性狀，為有效保護咖啡種質資源及品種改良提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為60份小粒種咖啡種質（表1），取自德宏熱帶農業科學研究所（農業部瑞麗咖啡種質資源圃），主要為波邦、鐵皮卡、卡杜艾、卡蒂姆、卡杜拉、薩其姆等品種類型。

1.2 試驗方法

1.2.1 農藝性狀測定鮮果重（kg）：在果實盛熟期，采摘單株鮮果，并稱取其重量，待全株果實采收結束時統計單株成熟鮮果重量。

干豆重（g）：在果實盛熟期，采摘鮮果。去中果皮，洗掉種子表面果膠，置于50℃烘箱烘72h，至帶種皮豆含水量約為12%時，測得的數據即為干豆重。

種子大小（長、寬、厚）：隨機抽取20粒種子。用游標卡尺測量每粒種子基部至頂部的長度，即為種子長;種子最大橫切面的最大直徑，即為種子寬;種子最大橫切面的最小直徑，即為種子厚。

鮮干比（%）：帶種皮豆樣品，去種皮制成標準商品豆，計算商品豆重占鮮果重的比例，重復3次，計算平均值。

百粒重（g）：隨機取100粒帶種皮豆稱重，重復3次，計算平均值。

出米率（%）：隨機稱取（100+1）g帶種皮豆樣品，去種皮制成標準商品豆并稱重，計算商品豆質量占帶種皮豆質量的比例，重復3次，計算平均值。

1.2.2 品質性狀測定咖啡因按GB/T 5009.139-2014的方法測定，綠原酸按GB/T 22250-2008的方法測定，蔗糖按GB 5009.8-2016第二法測定，蛋白質用杜馬斯燃燒法測定。

脂肪測定采用項目組先前研制的“咖啡脂肪含量測定的超聲超離方法，將樣品與石油醚混合液超聲提取（60℃水浴、時間3～7min、功率250W），通過冷凍離心分離固相與液相（溫度4℃、轉速5000～8000r·min、時間5～9min），烘干固相物質，計算脂肪含量。

1.2.3數據分析采用Microsoft Excel 2007軟件進行數據處理，計算平均值、標準差和變異系數，并參照謝向譽等的方法計算遺傳多樣性指數（H’），即H’=-∑PilnPi，Pi為性狀第i級別內材料份數占總份數的百分比。采用SPSS 19.0軟件進行相關性分析和主成分分析，利用k-均值分類法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 農藝性狀表型評價

不同咖啡種質農藝性狀變化較大，統計分析結果見表2。鮮果重變幅為0.79～2.97kg，平均1.87kg;干豆重變幅為300.49～592.68g，平均390.58g;鮮干比變幅為16.55%～48.79%，平均21.50%;種子長變幅為10.74～12.69mm，平均11.74mm;種子寬變幅為7.36～9.05mm，平均7.98mm;種子厚變幅為4.40～5.70mm，平均4.88mm;百粒重變幅為15.06～27.13g，平均19.51g;出米率變幅為78.63%～86.60%，平均84.01%。

由表2可知，60份咖啡種質農藝性狀存在很大差異，8個農藝性狀的變異系數變幅為1.97%～25.15%，差異非常明顯。變異系數的大小順序為鮮干比>鮮果重>干豆重>百粒重>種子厚>種子寬>種子長>出米率。8個農藝性狀中，變異系數以鮮干比最高（變異系數為25.15%），鮮干比最大值為48.79%、最小值為16.55%;其次是鮮果重（變異系數為19.85%），鮮果重最大值為2.97kg、最小值為0.79kg;以出米率變異系數最低（變異系數為1.97%），出米率最大值為86.80%、最小值為78.63%。鮮干比、鮮果重、干豆重變異系數大，說明這些性狀存在著豐富的變異，具有較好的遺傳改良基礎。出米率、種子長、種子厚的變異系數較小，說明他們一致性較強，具有較穩定的遺傳特性。

8個農藝性狀的遺傳多樣性指數在1.43～2.04，其遺傳多樣性指數由高到低依次為種子長>種子厚>種子寬、出米率>干豆重>鮮果重、百粒重>鮮干比。種子長的遺傳多樣性指數最高，其后依次是種子厚、種子寬和出米率，說明種子大小具有豐富的遺傳多樣性，但由于他們的變異系數較小，基于種子大小對咖啡種質資源改良篩選潛力較小。鮮干比的遺傳多樣性指數最低，遺傳多樣性較窄。綜上所述，60份咖啡種質資源的8個農藝性狀存在較明顯的差異，表現出不同程度的遺傳多樣性。

2.2 品質性狀評價

不同咖啡種質品質性狀變化較大，統計分析結果見表3。蛋白質變幅為11.98%～15.43%，平均13.40%;脂肪變幅為9.03%～15.91%，平均13.02%;綠原酸變幅為8.10～24.56mg·g，平均16.59mg·g;咖啡因變幅為7.62～11.80mg·g，平均9.89mg·g;蔗糖變幅為7.10～10.00g·hg，平均8.48g·hg。

60份咖啡種質品質性狀存在很大差異，蛋白質、綠原酸等5個性狀的變異系數為5.2%～22.68%，差異非常明顯。在5個品質性狀表現中，變異系數的大小順序為綠原酸>脂肪>咖啡因>蔗糖>蛋白質。綠原酸變異系數最大，最高含量為24.56mg·g、最低含量僅為8.10mg·g、平均值為16.59mg·g，說明綠原酸離散程度較大，穩定性較差，具有較好的遺傳改良基礎;脂肪的變異系數次之，為12.40%;咖啡因和蔗糖的變異系數分別為9.84%和9.42%;蛋白質變異系數最小，為5.20%。蛋白質、蔗糖、咖啡因的變異系數均較小，說明他們一致性較強，具有較穩定的遺傳特性。

5個品質性狀遺傳多樣性指數在0.55～2.07，其遺傳多樣性指數由高到低依次為綠原酸>脂肪>蛋白質>咖啡因>蔗糖。綠原酸遺傳多樣性指數最高（2.07），說明具有豐富的遺傳多樣性，而且其變異系數也最大（22.68%），表明基于綠原酸對咖啡種質資源篩選改良潛力較大。脂肪（2.06）、蛋白質（2.05）和咖啡因（1.99）的遺傳多樣性指數也較高，說明這些性狀具有豐富的遺傳多樣性，但其變異系數較小，基于這些性狀對咖啡種質資源進行改良篩選的潛力較有限。蔗糖的遺傳多樣性指數最低，說明供試咖啡種質在蔗糖方面的遺傳多樣性最小。綜上所述，供試咖啡種質的主要品質性狀具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 農藝性狀、品質性狀的相關性分析

對咖啡農藝性狀和品質性狀進行統計和分析（表4），結果表明，鮮果重與綠原酸呈極顯著負相關;干豆重與鮮干比、種子長、蛋白質呈極顯著正相關，與出米率呈顯著正相關，其中與種子長和鮮干比的相關系數分別為0.755和0.714，明顯大于與其他性狀間的相關系數，說明干豆重與種子長和鮮干比存在緊密關聯;鮮干比與種子長呈極顯著正相關;種子長與百粒重、出米率、蛋白質呈極顯著正相關，與蔗糖呈顯著正相關;種子厚與百粒重、出米率、蛋白質呈極顯著正相關，與脂肪呈顯著正相關;百粒重與出米率、蛋白質、脂肪呈極顯著正相關;出米率與蛋白質、脂肪呈極顯著正相關;蛋白質與脂肪呈極顯著正相關;咖啡因與蔗糖呈極顯著負相關。其余性狀間相關不顯著。

綜上所述，鮮果重越大，綠原酸含量越低;干豆重越大，鮮干比和種子長越大，出米率和蛋白質含量也越高;種子越長越厚，百粒重、出米率也越大，蛋白質含量也越高;出米率越高，蛋白質、脂肪含量越高;蛋白質含量越高，脂肪含量越高;咖啡因含量越高，蔗糖含量越低。

2.4主成分分析

8個農藝性狀和5個品質性狀的主成分分析結果（表5）顯示，前4個主成分（PCI+PC2+PC3+PC4）累計貢獻率為69.17%。PCI貢獻率為29.17%，種子長、種子寬、種子厚、百粒重和出米率在第1主成分有較高的載荷，特征值中貢獻最大的是百粒重，故第1主成分為百粒重的構成因子;PC2貢獻率為16.25%，鮮果重、干豆重、脂肪、綠原酸在第2主成分有較高的載荷，特征值中貢獻最大的是鮮果重，故第2主成分為鮮果重的構成因子;PC3貢獻率為12.35%，蛋白質、咖啡因在第3主成分有較高的載荷，其特征向量值中蛋白質貢獻最大，故第3主成分為蛋白質構成因子;PC4貢獻率為10.86%，鮮干比、綠原酸在第4主成分有較高的載荷，特征向量值中鮮干比貢獻最大，故第4主成分為鮮干比構成因子。可見，前4個主成分的12個性狀是構成小粒種咖啡種質多樣性的主要因素，也是小粒種咖啡育種中應重點考慮的性狀指標。

2.5 聚類分析

基于農藝性狀、品質性狀差異，對60份小粒種咖啡資源進行聚類分析，結果如圖1所示。在遺傳距離為25.0處，60份小粒種咖啡資源分為兩個大類群，第I類有53份資源，第Ⅱ類有7份資源，主要表現為鮮果重差異。第I類資源鮮果重均在2.20kg以下，第Ⅱ類資源鮮果重均在2.20kg以上。可見，小粒種咖啡種質資源的鮮果重存在明顯的差異。第1類又分為2個亞類，第I-1類包括49份資源，包含了卡蒂姆和薩其姆及未知品種類型的大多數資源，主要表現為比第1-2類有較大的鮮果重和種子寬，但綠原酸含量偏低，均在15.59mg·g以下。第I-1類又分為a和b兩個分支，a分支較b分支鮮果重大，綠原酸、咖啡因含量高。第1-2類有4份資源，分別是180、204、282和284，主要特點是鮮果重小，均在1.30kg以下。第Ⅱ類又分為兩個亞類，第Ⅱ-1類有3份資源，分別是10、51和88;第Ⅱ-2類有4份資源，分別是55、78、93和140。第Ⅱ-2類較第Ⅱ-1類具有更高的鮮果重和干豆重，鮮果重均在2.60kg以上，干豆重均在538.00g以上。綜上所述，第Ⅱ類鮮果重大，尤其是II-2類，可作為選育和改良品種的基本材料。

3討論與結論

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，生物遺傳變異均發生在分子水平，在不斷進化過程中形成了豐富的遺傳多樣性。種質資源遺傳差異大小直接影響性狀遺傳改良和研究利用的效果，優異基因能否被發掘與有效利用影響著新品種選育或新材料創制。目前，我國云南和海南等地已開展對咖啡種質資源的收集保存，周華等的研究結果表明了不同咖啡種質資源之間存在豐富的遺傳多樣性，閆林等、黃麗芳等、王曉陽等的研究結果也表明小粒種咖啡遺傳關系較緊密，但從農藝性狀和品質性狀方面進行種質資源遺傳多樣性分析還未見報道。變異系數反映了某性狀數據的離散程度，其大小與性狀的變異范圍呈正相關，變異系數越大，表明性狀的變異程度越大。本研究對60份小粒種咖啡種質資源的8個農藝性狀和5個品質性狀進行分析比較，鮮干比、鮮果重、干豆重、綠原酸的離散程度大，穩定性差，具有較好的遺傳改良基礎;出米率和蛋白質的離散程度較小，性狀表現較為穩定。遺傳多樣性信息指數是評價種質資源的主要指標之一，值越高，表明某性狀的多樣性越豐富。本研究中平均遺傳多樣性指數1.82，其中種子長（2.04）、綠原酸（2.07）、脂肪（2.06）、蛋白質（2.05）遺傳多樣性指數較大，鮮干比（1.43）和蔗糖（0.55）較小。不同咖啡種質間的性狀差異較大，表現出豐富的遺傳多樣性，且改良潛力大。

主成分分析是將多個變量轉化為少數幾個綜合因子，每個主成分基本上又能反映原始變量的大部分信息，其所含信息互不重復。本研究的前4個主成分提供了原性狀69.17%的信息，反映了所有表型性狀的大部分相關信息。種子厚、百粒重、鮮果重、鮮干比、蛋白質對咖啡性狀多樣性構成起主要作用，可見咖啡種質資源的分類受到多個性狀的共同影響。這些性狀不僅可作為咖啡種質鑒定評價的重要性狀，也可作為區分咖啡種質資源的主要性狀。前4個主成分間包含的性狀信息具有一定的相關性，且各性狀類型差異較大，各主成分性狀載荷值反映了主要性狀的育種選擇潛力。綜上所述，在育種工作中，抓住種子厚、百粒重、鮮果重、鮮干比、蛋白質等主要因子，可望縮短選育新品種或新品系的年限。

農藝性狀大多受多基因控制，不同性狀間存在不同程度的相關性，某一性狀的改變會導致其他相關性狀發生變化，因此在育種過程中改良重要性狀的同時可同步改良次要性狀。本研究發現，種子長和種子厚與百粒重、出米率、蛋白質均呈極顯著正相關，分別與蔗糖和脂肪呈顯著正相關;出米率與蛋白質、脂肪呈極顯著正相關;咖啡因與蔗糖呈極顯著負相關。說明在咖啡品種選育過程中，通過篩選種子長和厚的種質作為親本材料，可增加百粒重、出米率、蛋白質、蔗糖和脂肪等產量性狀和品質性狀;篩選咖啡因含量低的種質作為親本材料，可增加咖啡蔗糖含量，提升品質。

本研究利用聚類分析法對60份咖啡種質的13個性狀進行了聚類分析，讓性狀相近的聚為一類，使其同質化程度最高。每個組群具有特定的形態特征，以便更系統地分析咖啡種質資源的特點。第I類為單株鮮果重小的資源材料，這類材料具有較小的鮮果重和種子寬，綠原酸含量偏低等特點。第Ⅱ類的鮮果重大，具有較大的鮮果重和種子寬，但綠原酸含量偏低。可見，小粒種咖啡種質資源的鮮果重存在明顯的差異，尤其是Ⅱ-2類的4份種質，鮮果重和干豆重最大，可作為新品種選育和改良的基本材料。

60份咖啡種質資源存在豐富的遺傳多樣性，可通過引種馴化、雜交、嫁接和分子育種等技術把其優異基因延續下去。針對現有咖啡種質資源具有豐富的農藝性狀和品質性狀多樣性等特征，今后應在現有研究的基礎上，結合全基因組測序和代謝組學等方法，對各表型性狀進行精準鑒定、關聯分析，挖掘重要性狀優異基因，并與常規育種方法相結合，加快我國咖啡種質資源的創新利用和新品種選育進程。