豬IGFBP2基因多態性及其對蘇姜豬肉質性狀的影響

陶勇 陸建豪 任善茂

摘要：【目的】探討IGFBP2基因潛在的遺傳變異及其與蘇姜豬肉質性狀之間的關系?！痉椒ā坎捎肞CR-RFLP技術檢測IGFBP2基因在蘇姜豬、姜曲海豬、杜洛克豬中的Msp I酶切遺傳多態性，采用單因素方差分析法分析該多態位點對蘇姜豬肉質性狀的影響?！窘Y果】在3個豬種試驗群體，IGFBP2基因第2內含子內均發現了1個Msp I酶切多態性，存在A、B等位基因，AA、AB、BB基因型，優勢等位基因為B，優勢基因型為AB，多態信息含量均呈現中度多態。蘇姜豬試驗群體IGFBP2基因AA、AB型個體大理石紋顯著高于BB型（P<0.05），AA型個體五分制肉色和色差儀測得的a值均顯著高于AB、BB型（P<0.05）?！窘Y論】蘇姜豬試驗群體IGFBP2基因第2內含子內PCR-RFLP-Msp I多態性與部分肉質性狀間存在一定程度的顯著性相關，可以作為與豬肉質性狀相關的候選基因加以研究。

關鍵詞：豬;IGFBP2基因;PCR-RFLP-Msp I;肉質性狀;關聯分析

中圖分類號：S828 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1283-05

0 引言

【研究意義】胰島素樣生長因子結合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）屬于IGFBPs家簇，在動物外周循環和細胞外液中廣泛存在，在脂肪形成過程中發揮著十分重要的作用[1-2]。IGFBP2與胰島素樣生長因子2（IGF2）有較高的親和力，與IGF2結合后將其轉運到溶酶體降解，以調節IGF2的含量，并能抑制IGF2與MDBK細胞表面結合，進而抑制它們促有絲分裂活性功能[3]?！厩叭搜芯窟M展】目前，有研究報道IGFBP2基因多態性與動物生產性能、經濟性狀間存在關聯，發現了一些影響肉質性狀的SNPs與QTLs。楊華等[4]檢測發現在大白豬×梅山豬雜交豬試驗群體中IGFBP2基因第2內含子內存在1個C-T堿基突變，引起Msp I酶切位點的改變，關聯研究發現該多態位點與胭體性狀、肉質性狀間存在顯著相關關系。Rohrer等[5]采用182個微衛星標記掃描了370頭杜洛克豬X長白豬F2代群體的基因組，發現并證實豬15號染色體上IGBFP2基因所在區域內與大理石紋和嫩度相連鎖的QTL位點可以用來提高豬肉品質。Prasongsook等[6]在美國密歇根州立大學杜洛克豬X皮特蘭豬F2代資源群體中研究發現，IGFBP2基因不同基因型對失水率、pH₂₄、肉色、多汁性和嫩度等肉質性狀有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c】蘇姜豬是以地方品種姜曲海豬為母本，導人杜洛克豬血統，運用常規育種與現代分子遺傳育種手段相結合的方法培育而成的瘦肉型新品種豬，并于2013年成功通過國家畜禽遺傳資源委員會審定，獲得畜禽新品種證書。目前，關于蘇姜豬的研究主要集中在生產性能、屠宰測定等方面[7-8]，候選基因及其多態性與肉質性狀等性能之間相關關系的研究報道較少?！緮M解決的關鍵問題】為了尋找與蘇姜豬肉質性狀相關的遺傳標記，本試驗采用PCR-RFLP技術檢測3個豬種IGFBP2基因Msp I酶切片斷多態性，并分析了蘇姜豬不同基因型間肉質性狀的差異，以期為蘇姜豬持續選育及分子標記輔助選擇研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 蘇姜豬447頭飼養于江蘇蘇姜種豬有限公司，姜曲海豬109頭飼養于江蘇姜曲海種豬場，杜洛克豬218頭飼養于常州市康樂農牧有限公司。同一公司內飼養的育肥期試驗豬日齡、體重相近，公母各半，飼糧營養水平相同，飼養管理方式一致。

1.1.2 主要試劑與儀器 Msp I限制性內切酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker購自北京華越洋生物科技有限公司，KAPA DNA快速提取試劑盒購自上海捷易生物科技有限公司。主要儀器包括Q5000超微量核酸蛋白測定儀、ABI Veriti 96梯度PCR儀、WSC-S測色色差計。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織樣采集與DNA提取所有試驗豬在育肥結束銷售前逐頭采集耳組織樣0.5g，置于裝有70%酒精的Eppendorf管內，冰盒保存帶回實驗室。按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，采用超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度和純度，-20℃保存備用。

1.2.2 肉質性狀測定 蘇姜豬體重達100kg左右時，每個基因型選取8頭進行屠宰，從左半側胭體倒數第3～4胸椎處向后采集背最長肌20～30cm，按照“NY/T821-2004豬肌肉品質測定技術規范”測定剪切力、失水率、肉色、pH₂₄、大理石紋等肉質性狀指標。其中肉色采取5分制比色板評分法和WSC-s色差儀法2種方法測量，色差儀測的L值代表光反射值，a值和b值分別代表紅度和黃度值。

1.2.3 PCR擴增 根據楊華等[4]研究成果，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成一對引物，擴增IGFBP2基因第2內含子內245 by片段。引物序列分別為：上游，5'-GGTCT GATTG GAGGG GTGT-3';下游，5'-AGCCA AGGAG AAATG TGAAG G-3'。PCR擴增反應體系包括：DNA模板2.5μL，2×TaqPCR Mix 12.5μL，上下游引物（10μmol·L^-1）各1.0μL，加ddH₂O至總體積25.0μL。PCR反應程序：94℃預變性5min;94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，共計35個循環;72℃延伸10min，并在4℃條件下保存備用。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察擴增效果。

1.2.4 PCR-RFLP-Msp I酶切分析 符合要求的PCR擴增產物用Msp I進行酶切，酶切反應體系包括1×Buffer 1.5μL，Msp I限制性內切酶0.2μL（5U），PCR產物5μL，加ddH₂O至總體15μL，37℃酶切反應2h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測經過限制性內切酶Msp I酶切的產物，并凝膠成像系統下判斷基因型類型。按照劉海霞等[9]研究方法計算3個豬種試驗群體內的純合度（H₀）、雜合度（He）、有效等位基因數（N_e）、多態信息含量（PIC），并比較分析IGFBP2基因不同基因型對蘇姜豬肉質性狀的影響。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0GLM對數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 IGFBP2基因PCR擴增產物

IGFBP2基因第2內含子目標片段的PCR擴增產物電泳檢測結果見圖1。從圖1可見PCR產物的特異性非常好，擴增片段與目標片段大小一致，長度245bp，可以直接用來進行RFLP分析。

2.2 IGFBP2基因PCR-RFLP檢測分型

對3個豬種IGFBP2基因目標片斷的PCR擴增產物進行RFLP-Msp I分析，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖20結果發現，IGFBP2基因PCR產物在3個豬種試驗群體中均檢測到了Msp I酶切多態性，存在AA、AB和BB 3種基因型。

2.3 IGFBP2基因遺傳多態性分析

2.3.1 等位基因和基因型頻率 統計3個豬種試驗群體IGFBP2基因目標片段的等位基因和基因型頻率（表1）。由表1可知，3個豬種試驗群體中優勢基因型均為AB，優勢等位基因為B。

23.2 純合度、雜合度、有效等位基因數及多態信息含量3個豬種試驗群體H₀、He、Ne及PIC的統計結果見表2。由表2可知，3個豬種試驗群體的PIC均呈現中度多態，且姜曲海豬試驗群體的遺傳多樣性高于蘇姜豬、杜洛克豬試驗群體。

2.4 IGFBP2不同基因型對蘇姜豬肉質性狀的影響

蘇姜豬IGFBP2基因不同基因型個體間肉質性狀的關聯分析見表3。由表3可知，AA、AB型個體大理石紋顯著高于BB型（P<0.05），AB、BB型與AA型個體的五分制肉色和色差儀測得的a值間的差異達到顯著水平（P<0.05），其余指標間的差異均不顯著（P>0.05）。

3 討論與結論

IGFBP2是胰島素樣生長因子（Insulin-like growthfactor，IGF）家族中的一種結合蛋白，主要存在于動物組織和體液中，可參與調控細胞的生長和代謝，與細胞粘附、瘤血管形成密切相關[10]。IGFBP2的研究主要集中在人類醫學方面，許多腫瘤組織都有IGFBP2表達或表達水平升高，表明IGFBP2可能是一種腫瘤的分化程度的標志物[11-12]。

前期IGFBP2基因的研究主要集中在其結構與功能方面，目前有關IGFBP2基因多態性與經濟性狀的關聯研究逐漸增多。Zhao等[13]測序發現IGFBP2基因第2內含子區域內存在2個SNPs（C1107G、C11-30T）與兩個插入/缺失片段（552bp后TC，1115bp后GCCAGGT），京海黃雞試驗群體中AA型個體的出雛重、12周齡體重顯著高于AB型個體，A等位基因對個體體重有正面影響，并由此推測IGFBP2基因內含子2區域的突變可以用作京海黃雞體重的遺傳標記。Wang等[14]將豬IGFBP2基因定位于15號染色體（15q22-23），中國地方豬種攜帶的A等位基因（50%以上）比歐洲豬種要高，不同基因型個體間在前軀重、后軀重、前肢重、后肢重等生產性能間差異均達到顯著或極顯著水平。

本研究在蘇姜豬、姜曲海豬、杜洛克豬等3個試驗群體中均發現IGFBP2基因第2內含子區域內存在著1個MspI酶切位點多態性，獲得A、B2個等位基因，AB、AB、BB3種基因型。蘇姜豬試驗群體的多態信息含量為0.36，呈現出中度多態，由此可見蘇姜豬群體具備進一步選育的潛力。蘇姜豬IGFBP2基因不同基因型個體在大理石紋、肉色兩個指標中存在顯著差異，AA型個體的大理石紋、肉色均顯著高于BB型，這些結果與楊華等[4]、劉海霞等[9]的研究結論相似，但與Prasongsook等[6]在部分肉質指標間存在差異。Prasongsook等研究發現國外雜交商品豬群體中IGFBP2基因不同基因型的失水率、pH值、肉色等性狀均達到了顯著水平，而本試驗中卻沒有發現蘇姜豬試驗群體在不同基因間的失水率、pH值存在顯著差異，這可能與試驗豬的品種、數量、飼養管理、測定方法等因素存在著一定的關系。由于試驗條件的限制，本研究無法分析IGFBP2基因第2內含子內PCR-RFLP-Msp I多態位點對姜曲海豬、杜洛克豬肉質性狀的影響，等試驗條件具備后可作進一步的分析與探討。

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（責任編輯：張梅）

收稿日期：2019-06-26初稿;2019-09-04修改稿

作者簡介：陶勇（1975-），男，博士，副教授，主要從事畜禽遺傳資源保護與開發利用研究（E-mail：tyrsm1975tt@126.com）

通信作者：任善茂（1976-），女，副教授，主要從事動物營養與飼料科學的教學、科研與服務（E-mail：825587062@qq.com）

基金項目：江蘇高校“青藍工程”資助項目[2017（15）];江蘇農牧科技職業學院科研項目（NSF201602）