烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠抗氧化能力的影響

蔡華珍 李冬雪 肖和平

(滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000)

傳統經驗與近來的研究認為，烏雞黑色素具有滋補、抗衰老、抗疲勞、調理機體平衡等作用，是烏雞滋補健身、延緩衰老的物質基礎〔1，2〕。在烏雞黑色素性質的研究上實驗已證明：烏雞黑色素具有抗氧化作用〔2～4〕；通過對果蠅喂飼研究發現，烏雞黑色素能夠顯著延長果蠅的平均壽命〔5〕，然而在對小鼠體內的抗氧化指標的研究上卻未發現與對照組有顯著差異〔6〕。本研究旨在探討烏雞黑色素對衰老模型小鼠的肝臟、大腦及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及相關臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，平均體重24～30 g，購自安徽科技學院動物實驗中心。

1.2主要藥品與試劑 烏雞黑色素：從泰和烏雞(購自江西省泰和縣生物谷食品科技工業園)中提取；D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司)；考馬斯亮藍G250(中國醫藥上海化學試劑公司)；牛血清清蛋白(國藥集團化學試劑有限公司)。無水乙醇、冰乙酸、石油醚、乙醚、氯化鈉等均為分析純； SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1烏雞黑色素的提取工藝〔7〕全凈膛烏雞→剔骨取肉→絞碎→加熱(肉水比1∶1，100℃ 5 min)→木瓜蛋白酶酶解→風味酶酶解→滅酶→過濾→離心→收集沉淀物→醚洗、水洗至pH中性→沉淀物→凍干→黑色素。

1.3.2小鼠的分組及造模〔8，9〕昆明種小鼠80只，3月齡左右。普通飼料適應喂養6 d后，將小鼠隨機分為8組，其中，4組用于生理生化指標的測量，另4組用于臟器指數的測定，兩者分組相同，即每組10只，正常對照組、模型組、黑色素低劑量組，黑色素高劑量組。各組連續灌胃、注射43 d。模型組每日頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，并灌胃與黑色素組等體積的0.1%瓊脂液；正常對照組每日頸背部皮下注射等體積滅菌生理鹽水，灌胃與黑色素組等體積的0.1%瓊脂液；黑色素組每日頸背部皮下注D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1，黑色素低、高劑量組分別按900、1 800 mg·kg-1·d-1劑量灌胃黑色素，黑色素用0.1%瓊脂液分散。每周記錄1次體重，隨時觀察小鼠的生長情況。小鼠行動遲緩、毛色松散無光澤、自發性活動減少、形體瘦弱、呈現明顯的衰老特征時，證明衰老模型建立成功。于末次給藥1 d后，摘除眼球取血分離血清，4℃低溫保存備用；頸椎脫臼法處死動物，快速分離肝臟和腦組織，于-20℃凍存備用。進行各項指標測定。

1.3.3MDA含量、SOD、GSH-Px活力的測定 嚴格按照試劑盒說明書測定肝、腦組織以及血清中的MDA含量，SOD、GSH-Px活力。

1.3.4組織蛋白含量測定 考馬斯亮藍法〔10〕。

1.3.5小鼠器官指數的測定〔11〕頸椎脫臼法處死動物，快速取出腦、胸腺、脾、肝、腎，剔除表面脂肪，用4℃生理鹽水沖凈表面殘血，用濾紙吸收水分，精確稱取其重量，按照以下公式計算：器官指數=器官重(mg)/體重(g) 。

2 結 果

2.1烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠體貌特征及體重的影響 實驗開始2 w后，模型組小鼠毛發出現凌亂無光現象，注射處開始出現炎癥反應，其他組無此現象。4 w后模型組小鼠行動較為遲緩，毛色松散無光澤，炎癥加劇，但黑色素組小鼠生長良好，毛發光亮濃密，活潑好動，至第42天黑色素組模型小鼠一直生長良好，而模型組體形消瘦，脊椎隆起，行動遲緩。用藥后14 d內各組小鼠體重無明顯差異；到第21天，模型組體重比黑色素高劑量組的明顯降低(P<0.05)，但與其他各組間無顯著差異；第35天時，模型組體重均低于其他各組(P<0.05)；到了第42天，模型對照組與其他各組之間差異均達極顯著水平(P<0.01)，并且正常對照組的體重亦低于黑色素高劑量組(P<0.05)。這說明烏雞黑色素能夠抵御D-半乳糖的致衰老干擾，促進衰老模型小鼠的生長。見表1。

表1 烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠體重的影響

2.2烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠肝臟、大腦、血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響 正常對照組、黑色素組小鼠肝臟、大腦、血清中的SOD、GSH-Px活力極顯著高于模型組(P<0.01)，與黑色素低劑量組比較，高劑量黑色素對D-半乳糖致衰小鼠大腦中GSH-Px活力影響更顯著(P<0.01)，但黑色素各劑量組之間肝臟、大腦、血清中的SOD差異均不顯著。因此，烏雞黑色素能顯著提高D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦、血清中的SOD、GSH-Px活力。見表2，表3。

在對MDA含量的影響方面，衰老模型組小鼠肝臟、大腦和血清中MDA含量均極顯著高于其他各組(P<0.01)；黑色素高、低劑量組間肝臟和血清中MDA含量差別不大，但是大腦的MDA含量，卻是高劑量組極低于低劑量組(P<0.01)，這與黑色素高劑量組大腦中GSH-Px高活力相對應。表明烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠細胞脂質過氧化損傷有保護作用，尤其對大腦保護作用更顯著，其保護作用與黑色素成正比。見表4。

表2 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中SOD的影響

2.3烏雞黑色素對D-半乳糖衰老模型小鼠器官指數的影響 黑色素組各器官指數均極顯著高于模型組(P<0.01)，略高于正常對照組(P>0.05)。黑色素高劑量組各器官指數亦略高于黑色素低劑量組，但差異不顯著，說明黑色素可顯著提高D-半乳糖致衰小鼠的器官指數，但黑色素劑量影響差別不大。見表5。

表3 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中GSH-Px的影響

表4 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠肝臟、大腦和血清中MDA的影響

表5 烏雞黑色素對D-半乳糖致衰小鼠腦指數和臟器指數的影響

3 討 論

隨著年齡的增長，機體內自由基防御系統如SOD、GSH-Px等功能下降，這種平衡逐漸被破壞，造成自由基過剩。過量自由基可通過過氧化作用攻擊細胞膜及核酸、蛋白質和酶類等生物大分子，造成生物膜的結構損傷和功能障礙，DNA基因突變或復制異常及生物酶活力下降，最終導致細胞功能嚴重受損以至衰老、死亡〔12〕。

MDA是體內自由基引發脂質過氧化產物之一，其含量可間接判斷體內自由基對機體的損傷程度以及衰老的程度；SOD能及時清除機體生成的過量自由基，從而保護細胞免受氧自由基的攻擊，因而SOD活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力；GSH-PX是機體廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異性地催化還原型GSH對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能的完整作用〔12，13〕。

因此，通過測定自由基清除系統的SOD、GSH-Px等活力，以及MDA含量，可以觀察肌體的氧化損傷情況。

D-半乳糖所致亞急性衰老模型是與自然衰老所出現的生化改變相近的實驗動物模型〔14〕。D-半乳糖可導致糖代謝紊亂，蛋白質、脂肪代謝異常，使體細胞發生退行性變化，產生多項生化指標變化，如SOD等活性降低和MDA水平升高等〔13，15〕。

本實驗結果提示烏雞黑色素能提高衰老模型小鼠機體清除自由基的能力，降低機體內脂質過氧化程度，烏雞黑色素具有延緩衰老之功能。

但是，這一結果與胡泗才等〔3，16，17〕研究烏雞黑色素對老齡小鼠紅細胞及肝細胞SOD活性沒有明顯影響；對老齡小鼠的血漿過氧化脂質含量也沒有明顯影響結果不同。對此，周偉偉等〔18〕分析認為，烏雞黑色素性質較穩定，難溶于水等溶劑，胡泗才等試驗效果不理想的原因是未能找到溶解烏雞黑色素的溶劑，從而造成烏雞黑色素在機體內吸收效果不夠理想。但本研究認為，胡泗才等的結果可能是黑色素的飼喂方式所致，由于他們均采用將烏雞黑色素加入小鼠飼料中喂養，而小鼠的習性會啃咬部分食物用來磨牙，從而使得烏雞黑色素攝入量不夠。本試驗采用灌胃法則避免了黑色素的損失，烏雞黑色素的難溶性并未影響試驗效果，相反小鼠吸收效果良好，這也可能與小鼠的胃腸液功能等有關，具體的吸收機制目前尚不清楚。

4 參考文獻

1袁 纓，袁 星，白慶余，等.烏骨雞黑色素的一些基本結構特征的初步研究〔J〕.動物學報，1993；39(3)：287-91.

2李瑞成，尚永彪，管俊峰.烏骨雞黑色素及其研究進展〔J〕.肉類研究，2010(10)：54-9.

3蔡華珍，陳守江，張 麗，等.烏骨雞黑色素的酶法提取及其抗氧化作用的初步研究〔J〕.食品與發酵工業，2006；32(1):99-102.

4Lin LC，Chen WT.The study of antioxidant effects in melanin extracted from various tissues of animals〔J〕.Asian-Australasian J Animal Sci，2005；9(2):277-81.

5徐莘蓮，莊 蘇，陳伯祥.烏骨雞黑色素對延緩果蠅衰老的作用〔J〕.南京農業大學學報，1999；22(2):105-8.

6胡泗才，辜 清，林 剛，等.泰和烏骨雞實驗藥理學研究的若干進展〔J〕.中藥材，1999；22(12):660-1.

7蔡華珍，胥孝俊.酶法與酸法提取的烏雞黑色素的性能比較〔J〕.食品與發酵工業，2007；33(4)：65-8.

8苗明三.實驗動物和動物實驗技術〔M〕.北京：中國中醫藥出版社,1997：122-3.

9楊紅英，馬志紅，石玉娥，等.褪黑素對D-半乳糖衰老模型小鼠的作用〔J〕.中國藥理學通報,2000；16(4)：42-4.

10蕭 能，余瑞元，袁明秀，等.生物化學實驗原理和方法〔M〕.北京：北京大學出版社，2006：240-2.

11劉永源，賀松其，張錫滔，等.二陳湯對亞急性衰老小鼠的實驗研究〔J〕.遼寧中醫醫院學報，2003；5(4)：373-5.

12牛育鴻，陳婭萍.運動、自由基與衰老研究〔J〕.榆林學院學報，2009；19(2)：17-9.

13郝 軍，趙健雄，鄧 沂，等.健身寶對D-半乳糖擬衰小鼠SOD、MDA及其IL-2、IL-6的影響〔J〕.中醫藥學刊， 2004；22(7):1239-40.

14Song X， Bao M， Li D.Advance glycation in D-galactose induced mouse aging model〔J〕.Medch Aging Dev， 1999；108(3):239-45.

15孫 鵬，郭明秋，陳立茵，等.亞急性衰老小鼠脾臟T細胞CD137表達的研究〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2002；18(5)：429-31.

16胡泗才，王尚洪，李明慧，等.泰和烏骨雞及其黑素對小鼠紅細胞過氧化氫酶及血漿過氧化脂質的影響〔J〕.南昌大學學報，1999；6(23):105-7.

17胡泗才，李明慧，郭 琴.泰和烏骨雞及其黑素對果蠅壽命及小鼠SOD活性的影響〔J〕.南昌大學學報， 1999；23(4)：319-22.

18周偉偉，陳 中，芮漢明.烏雞黑色素的研究進展〔J〕.食品與機械，2006；22(4)：134-6.