枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發性物質的抑菌活性及其組分分析

梁艷瓊 唐文 董文敏 吳偉懷 李銳 習金根 譚施北 鄭金龍 黃興 陸英 賀春萍 易克賢

摘要：【目的】明確橡膠樹內生枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發性物質的抑菌活性及其組分，為橡膠樹病害的生物防治提供參考。【方法】以橡膠樹紅根病菌GP010為指示菌，分別以5種不同培養基LB、TSB-YE、TSB、NB和PDA為營養來源，利用雙皿對扣法和菌絲生長速率法評定不同營養條件下Czk1揮發性物質對病原菌的作用活性強弱，篩選產抑菌揮發性物質的最優培養基;通過雙皿對扣法測定Czk1揮發性物質對橡膠樹5種根病菌（紅根病菌、褐根病菌、白根病菌、紫根病菌和臭根病菌）和橡膠樹炭疽病菌的抑菌活性，并利用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜法（HS-SPME-GC-MS）鑒定Czk1的揮發性物質組分。【結果】在LB培養基中，Czk1在不同濃度下的抑菌活性均優于其他培養基，是Czk1產抑菌揮發性物質的最優培養基。Czk1揮發性物質對6種參試病原菌均表現出良好的抑制作用，Czk1菌液濃度為105 CFU/mL時抑制率均在50.00%以上，Czk1菌液濃度為108 CFU/mL時抑制率在90.00%以上;Czk1揮發性物質可抑制紫根病菌、炭疽病菌和臭根病菌色素的產生，促進褐根病菌產生色素，并導致紫根病菌、褐根病菌和炭疽病菌菌絲生長畸形;其對橡膠樹炭疽病菌孢子萌發抑制率為71.30%;其在土壤中對橡膠樹紅根病菌和褐根病菌仍具有較好的抑菌效果，抑制率分別為63.37%和54.57%。利用HS-SPME-GC-MS對Czk1所產揮發性物質組分進行分析，共分離鑒定獲得包括碳氫化合物、胺類、醇類、烯類、酚類、酯類、吡嗪類、醛類、酮類及其他類等33種揮發性物質。【結論】Czk1所產揮發性物質可作為生防資源應用于橡膠樹病害防治。

關鍵詞： 枯草芽孢桿菌;橡膠樹根病;揮發性物質;抑菌活性

中圖分類號： S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2465-10

Antifugal effect and components analysis of volatile organic compounds from Bacillus subtilis Czk1

LIANG Yan-qiong1， TANG Wen1， DONG Wen-min2， WU Wei-huai1， LI Rui1， XI Jin-gen1，

TAN Shi-bei1， ZHENG Jin-long1， HUANG Xing1， LU Ying1， HE Chun-ping1*， YI Ke-xian1*

（1Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests/Hainan Engineering Research Center for Biological Control of Tropical Crops Diseases and Insect Pests， Haikou? 571101， China; 2College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University， Nanjing? 210095， China）

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for the biological control of rubber tree diseases，the composition of volatile organic compounds of Bacillus subtilis Czk1（an endophyte of rubber tree） and its antagonistic activities were identified. 【Method】With Ganoderma pseudoferreum GP010 as the indicator bacteria and five media（LB， TSB-YE， TSB， NB and PDA） as nutrition source， the two-sealed-base-plates method and hyphagrowth rate method were used to detect the activity of Czk1 volatile organic compounds and to screen the optimum medium of produce antifungal volatile organic compounds under different nutrient conditions. The antifungal activity of Czk1 volatile organic compounds against five kinds root pathogens （G. pseudoferreum， Phellinus noxius， Rigidoprus lignosus， Helicobasidium compactum， Sphaerostilbe repens） and Colletotrichum gloeosporiodes of rubber trees was determined by the two-sealed-base-plates method. The volatile compounds from Czk1 were identified by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS）. 【Result】Antifungal activity of Czk1 on LB medium was better than other media. LB was the optimal medium for Czk1 producing antifungal volatile organic compounds. Czk1 volatile compounds showed high inhibitory effects on six pathogenic fungal. When the concentration of bacteria was 105 CFU/mL， the inhibitory rate was above 50.00%， and when the concentration was 108 CFU/mL， the inhibitory rate reached up to more than 90.00%. Czk1 volatile compounds could inhibit the production of H. compactum， P. noxius， S. repens and C. gloeosporiodes pathogen pigment， which led to hypha malformation of H. compactum，P. noxius and C. gloeosporiodes. Its inhibition rate on the spore germination of C. gloeosporioides was as high as 71.30%， and it still had good antifungal activity against G. pseudoferreum and P. noxius in soil， with the inhibition rates as 63.37% and 54.57%， respectively. The components of volatile organic compounds were analyzed by HS-SPME-GC-MS， 33 volatile organic compounds including hydrocarbons， amines， alcohols， alkenes， phenols， esters， pyrazines， aldehydes， ketones and others were isolated and identified. 【Conclusion】 Volatile organic compounds produced by Czk1 can be used as bio-control resources for the control of rubber tree diseases.

Key words： Bacillus subtilis; rubber tree root disease; volatile organic compounds; antifugal activity

0 引言

【研究意義】天然橡膠（Hevea brasiliensis）作為重要的工業原料，在我國熱帶地區廣泛種植（李建華等，2013;位明明等，2016）。隨著橡膠種植面積的擴大和種植年限的增加，各種橡膠樹病害的發生也日趨嚴重，其中，橡膠樹根病是橡膠樹毀滅性病害之一，是限制我國橡膠單產提高的關鍵因子（王樹明等，2014）。目前報道的橡膠樹根部病害有8種（黃蔚寒和王金林，2010），我國橡膠樹上已發現7種，其中危害最大的是紅根病和褐根病（李增平和羅大全，2007;梁艷瓊等，2016）。根部病害使橡膠樹根系壞死，根莖疏導功能被破壞，并導致整株死亡，造成巨大的經濟損失（高秀兵等，2010;何其光等，2011）。目前，防治橡膠樹根部病害主要采取挖溝隔離進行預防，使用十三嗎啉等化學藥劑進行灌根，但挖溝隔離耗時耗力，且只能起預防作用，無法從根本上挽救已染病橡膠樹;此外，藥劑灌根長期單一使用十三嗎啉，其防治效果會隨著使用年限增加而有所下降，且該藥劑價格昂貴，難以實現大面積推廣應用（羅卓軍等，2011;詹興球和蔡江文，2012;賀春萍等，2013）。因此，亟待尋求環境友好、操作簡便、價格便宜和安全有效的橡膠樹根病防治方法。【前人研究進展】利用微生物及其代謝產物控制病原體以防治植物病害日益受到人們的關注和重視。微生物主要是通過營養和空間位點競爭、分泌抗菌物質、誘導植物抗性和促進植物生長等方式發揮生防潛力（Zheng et al.，2013;Govindappa et al.，2014;Pieterse et al.，2014;陳志誼，2015;周小江等，2016）。其中，利用拮抗微生物產生的抗菌物質進行生物防治已成為研究的熱點，如抗菌蛋白和新型抗生素的開發及應用已日益廣泛和深入（秦楠等，2015;Delgado et al.，2015;向亞萍等，2016;Lee et al.，2016）。微生物代謝過程中產生的揮發性物質也是一個不可忽視的生防因子。周翠等（2011）報道枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）所產生的揮發性物質對楊樹潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）、石榴瘡痂病菌（B. dothidea）、蘋果輪紋病菌（B. dothidea）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、楊樹腐爛病菌（Valsa sordida）、桑紫紋羽病菌（Helicobasidium purpureum）、合歡枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）菌絲生長均具有一定的抑制作用。Rajer等（2017）報道枯草芽孢桿菌FA26產生的VOC顯著抑制馬鈴薯細菌環腐病菌（Clavibacter michiganensis sp.）的菌絲生長。Gao等（2018）研究發現，枯草芽孢桿菌CF-3培養24 h的發酵液中揮發性有機化合物可抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea）、炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioide）、擴展青霉（Penicillium expansum）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）的菌絲生長，平均抑菌率為59.97%。鄭香香等（2019）發現枯草芽孢桿菌X和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）B1、HB-2發酵液產生的揮發性氣體對早熟桃鏈格孢菌菌落的擴展有明顯抑制作用。【本研究切入點】微生物揮發性物質的潛在作用活性已在許多研究中得到證實，與脂肽類抗生素及抑菌蛋白等抑菌物質相似，揮發性物質在微生物的抑菌作用中亦占有一席之地。枯草芽孢桿菌菌株Czk1由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所特色熱帶作物病害課題組分離自橡膠樹根部，具有鐵載體產生能力，其抗菌譜廣，對橡膠樹5種根病菌紅根病菌（Ganoderma pseudoferreum）、褐根病菌（Phellinus noxius）、紫根病菌（H. compactum）、白根病菌（Rigidoprus lignosus）和臭根病菌（Sphaerostilbe repens）及橡膠樹炭疽病菌均具有較強的抑制作用，且抑菌效果穩定、持效期長;可誘導橡膠植株產生系統抗性;能分泌脂肽類抗菌物質，抑制橡膠樹根病菌和炭疽病菌生長（趙璐璐等，2011;樊蘭艷等，2013）。目前，針對枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發性物質的抑菌活性及其組分尚不明確。【擬解決的關鍵問題】以5種橡膠樹根病菌（紅根病菌、褐根病菌、紫根病菌、白根病菌和臭根病菌）及橡膠樹炭疽病菌為研究靶標，通過雙皿對扣法測定枯草芽孢桿菌菌株Czk1所產揮發性物質對病原真菌的抑菌活性，明確Czk1是否產生活性物質，并利用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術（HS-SPME-GC/MS）對Czk1產生揮發性物質的成分進行分析，評價其開發潛力，為橡膠樹病害的生物防治提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 拮抗細菌枯草芽孢桿菌菌株Czk1分離自海南省屯昌縣中坤農場11隊染病橡膠樹樹根，供試6種病原菌菌株信息見表1，均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離鑒定與保存。

1. 1. 2 培養基 LB培養基（LB液體培養基不加瓊脂）：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 8.0 g，瓊脂 20.0 g，ddH2O補足至1000 mL，pH 7.0;PDA培養基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖15.0～20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，ddH2O補足至1000 mL;TSB-YE培養基：大豆蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨15.0 g，酵母膏6.5 g，NaCl 5.0 g，ddH2O補足至1000 mL，pH 7.0;TSB培養基：大豆蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨15.0 g，NaCl 10.0 g，ddH2O補足至1000 mL，pH 7.0;NB培養基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏2.0 g，葡萄糖10.0 g，ddH2O補足至1000 mL，pH 7.0。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 外源營養對Czk1揮發性物質抑菌活性的影響 以橡膠樹紅根病菌GP010為指示菌，分別以5種不同培養基LB、TSB-YE、TSB、NB和PDA為營養來源，參照Gao等（2017）的雙皿對扣法，根據菌絲生長速率測定揮發性物質對病菌的抑制率。將Czk1于LB培養基中活化，挑取單菌落接種于50 mL LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min過夜培養，用平板菌落計數法調節菌液濃度為104、105、106、107和108 CFU/mL。取100 μL已培養好的各濃度Czk1發酵液，分別均勻涂布到含有上述5種固體培養基的培養皿皿底（直徑為9 cm）。挑取病原菌菌塊（直徑5 mm）接種于含有PDA培養基的培養皿皿蓋，然后將接種有真菌的皿蓋與涂有細菌的皿底對扣，用封口膜密封，于28 ℃恒溫培養。以涂布不接細菌發酵液的各培養基為對照，當對照組菌絲長至2/3培養皿時，采用十字交叉法測量菌落直徑，根據公式（1）計算抑制率，每處理重復5次。以抑制率評定不同營養條件下Czk1所產揮發物的作用活性強弱，篩選產抑菌揮發物質的最優培養基供后續試驗使用。

抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理組菌落直

徑）/對照組菌落直徑×100 （1）

1. 2. 2 Czk1揮發性物質的抑菌活性測定 以6株供試病原菌菌株GP010、Pn006、HC001、RL001、Sr001和RC178為指示菌，測定Czk1揮發物對病原真菌的抑制活性。選取1.2.1中篩選出的最優培養基為細菌生長培養基，PDA培養基為病原真菌生長培養基，參照1.2.1的方法，每處理重復5次，以不接種拮抗菌的各培養基為對照，待對照組菌絲長至2/3平皿時，測量各平皿菌落直徑。按公式（1）計算抑制率。

1. 2. 3 Czk1揮發性物質對病原菌菌絲形態的影響 以6株供試病原菌菌株GP010、Pn006、HC001、RL001、Sr001和RC178為指示菌，具體操作方法同1.2.1，挑取培養5 d的病原真菌菌落邊緣菌絲，在光學顯微鏡下觀察處理組與對照組菌絲形態差異。

1. 2. 4 Czk1揮發性物質對病原真菌色素形成的影響 以產色素的病原真菌HC001、RC178、Pn006和Sr001為指示菌，具體操作方法同1.2.1。當對照組或處理組菌落產生大量色素時，觀察處理組病原菌產生色素的情況。

1. 2. 5 Czk1揮發性物質對炭疽病菌孢子萌發的影響 以橡膠樹炭疽菌RC178為指示菌，測定Czk1對病原真菌孢子萌發的影響。將RC178接種在PDA培養基上，于28 ℃培養6 d，用滅菌水輕輕洗下表面孢子，調節孢子懸浮液濃度為106 CFU/mL備用。孢子萌發采用水瓊脂法，將500 μL水瓊脂溶液均勻涂布在載玻片上，待載玻片表面的水瓊脂凝固后，取30～50 μL孢子懸浮液平鋪在水瓊脂表面。吸取100 μL Czk1發酵液（108 CFU/mL）涂布于LB培養基上，在距離培養皿中心2 cm處放置2個滅菌的牛津杯，將涂有孢子懸浮液的載玻片放置在牛津杯上，保證真菌孢子與細菌不直接接觸，蓋上培養皿蓋并密封。以不涂布細菌發酵液的LB培養基為對照，28 ℃培養12 h后統計視野下孢子萌發率，按公式（3）計算孢子萌發抑制率，每處理重復3次，每個重復隨機觀察5個視野，每處理統計100個孢子。

孢子萌發率（%）=孢子萌發數/觀察總孢子數×

100 （2）

孢子萌發抑制率（%）=（對照萌發率-處理萌發率）/

對照萌發率×100 （3）

1. 2. 6 土壤中Czk1揮發性物質的抑菌活性室內測定 為進一步評價Czk1揮發物的抑菌活性，以GP010和Pn006為指示菌，將細菌混合在土壤中進行活性測定。滅菌土過40目篩，取10 g滅菌土混合10 mL細菌發酵液（108 CFU/mL），加入滅菌的培養皿皿底，將病原菌菌塊（直徑5 mm）接種于含有PDA培養基的培養皿皿蓋，將皿蓋與皿底對扣，密封培養，以加入等量無菌水的滅菌土為對照，待對照組病原菌長至2/3平皿時，測量菌絲生長直徑，計算抑制率，判定Czk1在土壤中產揮發物的能力及抑菌活性。

1. 2. 7 Czk1揮發性物質的GC-MS鑒定 參考Gao等（2017）、Gao等（2018）的方法，在20 mL滅菌的頂空瓶中制作優化的斜面培養基，取50 ?L Czk1種子液涂布接種于斜面培養基，用帶有膠墊的瓶蓋迅速密封，瓶蓋外層再用封口膜密封，置于28 ℃生化培養箱中培養48 h，以不接種的斜面培養基為空白對照，每處理重復3次。利用固相微萃取方法萃取頂空瓶中的揮發物。先將50/30 ?m DVB/CAR/PDMS、100 ?m PDMS、7 ?m PDMS和65 ?m PDMS/DVB萃取纖維頭（Supelco，USA）老化，然后將SPME針管插入頂空瓶中，于34 ℃水浴鍋中萃取吸附30 min;將萃取好的SPME纖維頭插入氣相色譜—質譜聯用儀進樣口，解析3 min后啟動儀器開始采集數據。色譜柱：HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）;色譜條件：不分流模式;升溫程序：50 ℃保持2 min，再以4 ℃/min的速率升至100 ℃，保持1 min，然后再以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持1min，最后以25 ℃的速率升至250 ℃，保持5 min;氣相進樣口溫度為250 ℃;載氣：氦氣。質譜條件：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍35～600 m/z。以不接Czk1的空白培養基為對照。將所得氣體成分的質譜分別與國際標準數據庫比對（Library of the National Institute of Standards and Technology，NIST），匹配率>85%，鑒定出揮發性物質成分后，再將對照和處理中同時存在的化合物成分去掉，最終確定揮發性物質的組分。

2 結果與分析

2. 1 外源營養對Czk1揮發性物質抑菌活性的影響

Czk1在不同營養條件下所產揮發性物質對供試病原真菌菌絲生長的抑制作用如圖1所示。結果表明，在不同培養基培養條件下，Czk1揮發性物質的抑菌活性存在明顯差異，其中，在LB和PDA培養基條件下，其抑菌活性優于TSB和TSB-YE培養基條件;在NB培養基中，Czk1在較低培養濃度（104～105）時所產揮發性物質抑菌活性較弱，在較高培養濃度（106～108）時明顯增強;而在LB培養基中，Czk1在不同濃度下的抑菌活性均優于其他培養基，因此，選擇LB培養基為枯草芽孢桿菌菌株Czk1產揮發性物質的最優培養基。

2. 2 Czk1揮發性物質對病原真菌的抑制活性

Czk1所產揮發性物質對供試病原真菌抑制活性如表2所示。結果表明，Czk1所產揮發性物質對6種橡膠樹病原真菌具有強烈的抑制作用，隨著Czk1菌液濃度的增加，抑制作用逐漸增強，當菌液濃度為105 CFU/mL時，所產揮發性物質對6種病原真菌生長的抑制率均在50.00%以上;當菌液濃度為108 CFU/mL時，抑制率在90.00%以上。

2. 3 Czk1揮發性物質對病菌菌絲形態的影響

挑取揮發性物質處理組的病原菌邊緣菌絲在顯微鏡下觀察，結果（圖2）發現，Czk1所產揮發性物質導致橡膠樹紫根病菌HC001、褐根病菌Pn006和橡膠樹炭疽病菌RC178菌絲生長畸形，與對照組相比，處理組菌絲變細，出現扭曲、打結，而對橡膠樹紅根病菌GP010、白根病菌RL001和臭根病菌Sr001的菌絲形態無明顯影響。

2. 4 Czk1揮發性物質對病原真菌色素形成的影響

如圖3所示，Czk1所產揮發性物質能完全抑制紫根病菌HC001和炭疽病菌RC178的色素產生;對臭根病菌Sr001的色素有輕微的抑制作用;能促進褐根病菌Pn006產生色素，在對照組尚未產生色素時，處理組已產生大量色素。說明Czk1揮發性物質對真菌產色素的影響不是簡單的抑制或促進作用，而是針對不同真菌會產生不同的影響。

2. 5 Czk1揮發性物質對炭疽病菌孢子萌發的影響

孢子萌發試驗結果顯示，對照組橡膠樹炭疽病菌RC178孢子的萌發率為65.52%，經Czk1揮發性物質處理的炭疽病菌孢子萌發率僅18.81%，萌發抑制率達71.30%。顯微鏡觀察發現，處理組孢子形態與對照組無明顯差異（圖4），說明Czk1揮發性物質雖可抑制病原菌孢子萌發，但不會導致孢子畸形。

2. 6 土壤中Czk1揮發性物質的抑菌活性室內測定結果

當Czk1發酵液濃度為108 CFU/mL時，所產揮發性物質對橡膠樹紅根病菌GP010和褐根病菌Pn006的抑制率分別為63.37%和54.57%（圖5），表明Czk1在土壤中所產揮發性物質對病原真菌仍具有較好的抑制作用，是其應用于生產實際的基本保障。

2. 7 Czk1揮發性物質的GC-MS鑒定結果

通過GC-MS對Czk1揮發性物質進行測定，總離子流圖如圖6所示。依據NIST標準譜庫將所測的揮發性物質進行物質匹配分析，排除LB培養基處理及Czk1+LB培養基處理中共有的物質，將4種萃取頭分別鑒定得到的揮發性物質進行匯總，共收集獲得33種揮發性物質，包括碳氫化合物（13種）、胺類（1種）、醇類（1種）、烯類（1種）、酚類（4種）、酯類（3種）、吡嗪類（1種）、醛類（2種）、酮類（5種）和其他類（2種）（表3）。

3 討論

國內外研究發現，細菌所產揮發性物質拮抗植物病原真菌的方式主要表現為：抑制孢子形成或萌發，導致孢子畸形（崔曉等，2019）;抑制菌絲生長，導致菌絲生長畸形（崔曉等，2019）;抑制菌絲色素生成（Chaurasia et al.，2005;Elkahoui et al.，2015;Raza et al.，2015）等。黃福興（2008）研究發現，枯草芽孢桿菌BS-2所產揮發性物能顯著抑制木霉（Trichoderma）菌絲的生長及孢子萌發。張成省等（2009）研究發現，枯草芽孢桿菌Tpb55菌株所產揮發性物質對煙草赤星病菌（A. alternata）具有抑制作用，其不僅能抑制病原菌菌絲生長及孢子產生，還能延緩菌絲黑色素的生成。周翠等（2011）從石榴果實中分離得到一株枯草芽孢桿菌，其揮發性物質對8種林果病原菌具有抑制作用，且能導致部分病原真菌菌絲畸形并抑制病原真菌色素的產生。本研究中，Czk1所產揮發性物質對6種橡膠樹病原真菌的生長均具有明顯的抑制作用，導致部分真菌菌絲畸形;該菌除僅對橡膠樹褐根病菌色素的產生有促進作用外，對橡膠樹紫根病菌HC001、炭疽病菌RC178和臭根病菌Sr001的色素產生均有抑制作用;同時，揮發性物質能抑制橡膠樹炭疽病菌RC178孢子的萌發。本研究結果表明，Czk1揮發性物質對不同病原真菌產生不同的抑制效果，但其作用方式是否一致還有待進一步探究。

與脂肽類物質及其他抗菌物質相比，揮發性物質中的抑菌物質更易在空氣、土壤中擴散和滲透，能更高效抑制病原菌（Tahir et al.，2017a;王靜等，2018）。本研究中，Czk1在土壤中所產揮發性物質對橡膠樹紅根病菌GP010和橡膠樹褐根病菌Pn006的抑制率分別為63.37%和54.57%，再次印證揮發性物質可在土壤中滲透、擴散，更能有效抑制病原菌。

利用微生物正常生命代謝活動獲得天然的揮發性有機化合物，是近年來國際上較活躍的研究領域。對這些天然的、非化學合成氣體物質的開發和利用逐步受到關注，而成為研究熱點（陳奕鵬等，2018）。芽孢桿菌具有廣譜抑菌活性，可產生多種揮發性抑菌物質，利用其揮發性抑菌物質在植物促生、抗性增強和病害防控等方面的研究也越來越受關注。大量研究表明，芽孢桿菌產生的許多揮發性化合物如醇類、酸類、醛類、酮類和酯類等可在不同程度上抑制植物病原真菌的生長（陳華等，2008;Ongena and Jacques，2008;李寶慶等，2010;Raza et al.，2016）。Gao等（2017）報道貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）ZSY-1產生的揮發性物質（2，5-二甲基吡嗪、苯并噻唑、4-氯-3-甲基苯甲酸和2，4-二叔丁基苯酚）對Alternaria solani和Botrytis cinerea具有顯著的抗真菌活性。Gotor-Vila等（2017）發現解淀粉芽孢桿菌CPA-8產生的揮發性物質（1，3-戊二烯、3-羥基-2-丁酮和噻吩）對3種甜櫻桃果實采后病害病原菌Monilinia laxa、M. fructicola和Botrytis cinera具有較好抑制作用。Tahir等（2017a）發現枯草芽孢桿菌SYST2產生的揮發性物質（沙丁胺醇和1，3-丙二醇）可促進植物生長。Tahir等（2017b）報道解淀粉芽孢桿菌FZB42和LSSC22產生的揮發性物質（苯甲醛、1，2-苯并異噻唑-3-酮和1，3-丁二烯）顯著抑制青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的菌落大小、細胞活力和運動性，并對趨化性產生負面影響。本研究中，枯草芽孢桿菌Czk1產生的揮發性物質同樣可有效抑制6種橡膠樹病原真菌的菌絲生長和炭疽菌孢子萌發，但該菌株揮發性物質中的主要抑菌組分具體是哪一種成分還有待進一步證實。

枯草芽孢桿菌作為植物病害生物防治的重要資源之一，其多種多樣的生防機制是其在生物農藥領域廣泛應用的基本前提。生防枯草芽孢桿菌能分泌多種抗菌物質并對寄主植物有促生作用（Ryu et al.，2004;Farag et al.，2006;Rath et al.，2018），能誘導植物獲得系統抗性（張振華，2011），多種機制相互結合，在防治植物病害方面具有巨大潛力。而揮發性物質在土壤和空氣中具有更強的滲透和擴散能力，在生防菌拮抗病原菌的過程中發揮重要作用（陳華等，2008;李寶慶等，2010;Li et al.，2012）。樊蘭艷等（2013）通過提取枯草芽孢桿菌Czk1發酵液中的抑菌物質，發現該菌株能產生脂肽類物質抑制病原真菌生長。本研究分析了Czk1揮發性物質對橡膠樹病原真菌的抑制作用，發現其抑菌作用并不單純依靠脂肽類物質，而是多種機制相互結合、相互促進的結果，該結論為橡膠樹病害的生物防治打下了理論基礎。

4 結論

枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發性物質對供試5種橡膠樹根病菌和橡膠樹炭疽病菌均具有一定的抑制作用，其對病原真菌菌絲形態及產色素的影響各不相同;Czk1在土壤中所產揮發性物質對橡膠樹2種主要根病菌紅根病菌和褐根病菌均具有較好的抑制效果。因此，Czk1所產揮發性物質可作為生防資源應用于橡膠樹病害防治。

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（責任編輯 麻小燕）