酸棗仁湯對慢性睡眠剝奪大鼠視交叉上核生物鐘基因 Clock和Bmal1表達的影響

張付民　冉仁國　趙賓賓

〔摘要〕 目的 觀察酸棗仁湯對慢性睡眠剝奪大鼠視交叉上核（uprachiasmatic nucleus， SCN）生物鐘基因Clock和Bmal1蛋白表達的影響。方法 將實驗大鼠隨機分為空白組、模型組、舒樂安定組和酸棗仁湯組，除空白組外，其他各組用多平臺水環境法制定慢性睡眠剝奪模型并予以相應干預。采用自主活動測試儀記錄大鼠自主活動時間，免疫組化和Western blot檢測SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平。結果 與空白組比較，模型組大鼠自主活動時間TL（光照時段4個點之和）、TD（黑暗時段4個點之和）、TALL（光照+黑暗8個時段之和）明顯增加（P<0.01）;SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平下降（P<0.01）。干預后，與模型組比較，舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠TL、TD、TALL均減少（P<0.01或P<0.05）。舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達上升（P<0.01或P<0.05）。結論 酸棗仁湯能改善慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態，其機制可能與酸棗仁湯調節大鼠SCN中Clock和Bmal1的表達有關。

〔關鍵詞〕 視交叉上核;酸棗仁湯;睡眠剝奪;生物鐘基因;Clock;Bmal1;自主活動時間

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.005

Effect of Suanzaoren Decoction on Expression of Circadian Genes Clock and Bmal1 in the Suprachiasmatic Nucleus in Chronically Sleep-Deprived Rats

ZHANG Fumin1， RAN Renguo1*， ZHAO Binbin2

（1. Enshi Central Hospital of Hubei Province， Enshi， Hubei 445000; 2. School of Basic Medical Sciences，

Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Suanzaoren Decoction on the protein expression of circadian genes Clock and Bmal1 in the suprachiasmatic nucleus （SCN） in chronically sleep-deprived rats. Methods The experimental rats were randomly divided into blank group， model group， Eurodin group， and Suanzaoren Decoction group. All rats except those in the blank group were subjected to a multi-platform water bath to establish a model of chronic sleep deprivation， and each group received the corresponding treatment. An autonomic activity recorder was used to record the time of autonomic activities of the rats. Immunohistochemistry and Western blot were used to measure the protein expression of Clock and Bmal1 in the SCN. Results Compared with the blank group， the model group showed significantly increased TL （sum of automatic activity time recorded at four time points in the light）， TD （sum of automatic activity time recorded at four time points in the dark）， and TALL（sum of automatic activity time recorded at eight time points in the light and dark） （P<0.01）， and significantly decreased protein expression levels of Clock and Bmal1 in the SCN （P<0.01）. Compared with the model group， the Eurodin group and Suanzaoren Decoction group showed significantly decreased TL， TD， and TALL after administration （P<0.01 or P<0.05）， and significantly increased protein expression levels of Clock and Bmal1 in the SCN （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Suanzaoren Decoction can improve the sleep state of chronically sleep-deprived rats， which may be related to its regulation of the expression of Clock and Bmal1 in the SCN of rats.

〔Keywords〕 suprachiasmatic nucleus; Suanzaoren Decoction; sleep deprivation; circadian gene; Clock; Bmal1; time of autonomic activity

失眠是以入睡難、易醒、睡眠欠深度為主要癥狀的臨床常見病癥[1]，嚴重困擾著患者的生活和工作，已成為一種新的流行病[2]。據中國睡眠研究會2016年公布的睡眠調查結果顯示，中國成年人失眠發生率高達38.2%，明顯高于發達國家，超過3億中國人有睡眠障礙[3]。近年研究發現[4]，失眠與生物鐘調節基因失調有關。視交叉上核（suprachiasmatic nucleus， SCN）是哺乳動物晝夜節律調節系統的中樞結構，可調節身體內各種晝夜節律活動[5]。研究發現，SCN中Clock和Bmal1的表達失調與失眠癥密切相關[6]。酸棗仁湯是臨床治療慢性失眠的常用方，能顯著改善患者的睡眠質量，但其作用機制尚未完全明確。為進一步探明酸棗仁湯改善睡眠的作用機制，本實驗擬采用多平臺水環境睡眠剝奪法建立慢性睡眠剝奪大鼠模型，用免疫組化和Western blot檢測SCN中Clock和Bmal1蛋白的表達，以期為酸棗仁湯治療失眠提供部分實驗依據。

1 材料

1.1? 動物

成年健康SPF級SD雄性大鼠40只，體質量為200～250 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。

1.2? 主要藥品及試劑

酸棗仁湯由湖北省恩施州中心醫院中藥房提供，酸棗仁湯按方劑學[7]計量配伍，即酸棗仁30 g，知母9 g，茯苓6 g，川芎6 g，甘草3 g。煎煮前用純水將藥物浸泡20 min，浸泡好后，先后用武火和文火煎煮20 min，濾出藥液，再次加水煮開，濾出藥液，混勻2次煎取的藥液，用旋蒸儀濃縮藥液至每毫升藥液含生藥0.486 g。舒樂安定，北京益民藥業有限公司，批號H20170625。Clock一抗兔抗鼠抗體，美國Chemi-Con公司，批號：H77260。Bmal1一抗兔抗鼠抗體，美國Chemi-Con公司，批號：H47110。二抗羊抗兔抗體，武漢科瑞生物技術有限公司，批號20170315。Dako LSAB2通用性免疫組化試劑盒，丹麥Dako公司，批號SU187565。DAB濃縮型顯色試劑盒，北京杰輝博高生物技術有限公司，批號KS214968。

1.3? 主要儀器

參考文獻[8]自制睡眠剝奪箱，箱體大小為72 cm×48 cm×50 cm，箱內置6個連體直徑為8 cm，高為8 cm的圓形平臺，呈2×3排列。ZZ-6型自主活動測試儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）、Universal Hood Ⅲ型凝膠圖像成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1? 動物分組

適應性飼養1周后將大鼠隨機分為空白組、模型組、舒樂安定組和酸棗仁湯組，每組10只，除空白組外，其他各組用多平臺水環境法以制定慢性睡眠剝奪模型[9]。

2.2? 慢性睡眠剝奪模型的建立及干預

將模型組、舒樂安定組和酸棗仁湯組3組大鼠放在多平臺水環境中進行睡眠剝奪，于15時到次日8時連續18 h睡眠剝奪，連續剝奪21 d。大鼠入睡或肌肉松弛時就會掉入水中，以此達到睡眠剝奪的目的。

造模完成后，根據“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”計算動物給藥劑量，舒樂安定組大鼠按0.18 mg/（kg·d）給藥，酸棗仁湯組按4.86 g/（kg·d）給藥，給藥容量均為1 mL/100 g，定于每天中午12時給藥，連續灌胃2周，1次/d?？瞻捉M和模型組給予等體積的生理鹽水，療程同酸棗仁湯組。

2.3? 動物取材及處理

自主活動實驗完成后取材，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉好后斷頭取腦，冰上分離大鼠下丘腦，鏡下再分離SCN腦組織，置液氮速凍，24 h內移于-80 ℃冰箱保存。

2.4? 指標檢測

2.4.1? 自主活動時間檢測? 末次灌胃結束后12 h，應用自主活動測試儀觀察大鼠自主活動時間。實驗前將自主活動測試儀設置為12D/12L光暗循環，即8：00-20：00為光照時間，21：00-7：00為黑暗時間。分別于0：00、3：00、6：00、9：00、12：00、15：00、18：00和21：00觀察大鼠自主活動時間，每次觀察3 min。用TALL表示大鼠8個時點自主活動時間之和，TL表示光照時段4個時點自主活動時間之和，TD表示黑暗時段4個時點自主活動時間之和。分析和比較4組TALL、TL和TD。

2.4.2? 免疫組化檢測SCN中Clock、Bmal1蛋白表達水平? 自主活動時間檢測完畢后取材，用10%水合氯醛經腹腔注射麻醉（4 mL/kg），麻醉好后用4%多聚甲醛經心臟灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h。固定好后，石蠟包埋切片和脫水，用3%H2O2浸泡15 min，PBS沖洗3次，每次3 min;分別加入一抗Clock和一抗Bmal1（Clock稀釋度為1∶400，Bmal1稀釋度為1：200），37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，每次3 min;加入二抗（稀釋度為1∶3 000），37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min;DAB顯色5 min，依次水洗、復染、脫水、透明、封片和觀察。每張切片隨機選取5個高倍（×400）視野，用Image Pro-Plus 6.0軟件進行圖像處理。獲取累積光密度（IOD），進行數據分析。

2.4.3? Western blot檢測SCN中Clock、Bmal1蛋白表達水平? 用Western blot檢測4組大鼠SCN中Clock和Bmal1的蛋白表達量，內參為β-actin。取SCN腦組織20 mg，加蛋白裂解液，冰上研磨，以4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA蛋白質試劑盒分別測定4組蛋白量;依次加樣、凝膠電泳、轉膜和室溫封閉;按抗體說明書加入一抗Clock和一抗Bmal1（Clock稀釋度為1∶400，Bmal1稀釋度為1∶200），置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗（稀釋度為1∶3 000），ECL顯色;置于凝膠圖像成像分析系統，曝光各組蛋白條帶，拍照，分析灰度值。

2.5? 統計學方法

所有數據均運用統計軟件SPSS 19.0處理，實驗數據以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD法，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1? 自主活動時間檢測結果

從表1和圖1可以看出，與空白組比較，模型組大鼠TL、TD、TALL明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠TL、TD、TALL均有減少（P<0.01，P<0.05）。

3.2? 免疫組化實驗結果

從圖2、圖3和表2可以看出，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平較高;造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平相比，模型組下降（P<0.01）;給藥后，舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠相比，模型組SCN中Clock和Bmal1蛋白表達均上升（P<0.01，P<0.05）。

3.3? Western blot實驗結果

從圖4和表3可以看出，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平較高;造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1蛋白表達水平下降（P<0.01）;給藥后，舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠相比模型組SCN中Clock和Bmal1蛋白表達均上升（P<0.01，P<0.05）。

4 討論

酸棗仁湯出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》[10]，由酸棗仁、川芎、茯苓、知母和炙甘草組成，主治“虛勞虛煩不得眠”，方中酸棗仁養血補肝、寧心安神，為君藥;茯苓寧心安神，知母滋陰清熱，二者共為臣藥;川芎調暢肝氣，為佐藥;炙甘草調和諸藥，為使藥，全方共奏養血滋陰、除煩安神之功。失眠患者常有煩躁不安的行為表現，尤其是夜晚入睡時[11]。這種“煩躁不安”在睡眠剝奪動物模型身上就表現為晝夜活動節律失調[12]。本實驗發現，通過睡眠剝奪，模型組大鼠活動時間明顯增加（P<0.01），與正常組比較，模型組大鼠晝夜活動節律失調明顯失調，而給與酸棗仁湯后，睡眠剝奪模型大鼠自主活動時間明顯減少（P<0.01，P<0.05），晝夜活動節律失調明顯好轉，這說明酸棗仁湯可以改善睡眠剝奪模型大鼠的睡眠狀態。

SCN是哺乳動物晝夜節律調節系統的中樞結構，可調節身體內各種晝夜節律活動[5]。研究發現[13]，SCN中存在多種與睡眠節律相關的基因，如Per1、Per2、Clock、Bmal1等，其中已明確證實[14]Clock和Bmal1可以控制睡眠的穩態， 二者的表達紊亂可導致睡眠-覺醒失調。有研究發現[15]，失眠患者SCN中Clock和Bmal1表達明顯低于正常人，而本實驗發現，空白組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達水平較高。造模后，模型組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達水平下降。給藥后，舒樂安定組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Clock和Bmal1表達上升。

綜合分析，課題組認為酸棗仁湯能改善慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態，其機制可能與酸棗仁湯調節大鼠SCN中Clock和Bmal1的表達有關。這為酸棗仁湯防治失眠提供了新思考和新靶點。

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