桃紅四物湯對急性深靜脈血栓模型大鼠血清 IL-6和TNF-α水平的影響

柳景紅　劉登義　陳振中　李樂平　曹建雄

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor-necrosisfactor-α，TNF-α）與白介素- 6（interleukin-6，IL-6）水平的影響。方法 將80只雄性SD大鼠隨機分為假手術（A）、DVT模型（B）、桃紅四物湯（C）、阿司匹林（D）4組，每組20只。A組：只開腹，不結扎股靜脈，再灌胃生理鹽水;B組：予以結扎近心端左股靜脈造模后灌胃生理鹽水;C組：予以結扎近心端左股靜脈造模后桃紅四物湯灌胃給藥;D組：予以結扎近心端左股靜脈造模后灌胃阿司匹林;7 d后停止灌胃，分別于術前、術后第1天、7天用放射性免疫分析法測定各組血清中TNF-α、IL- 6 的水平，并進行組間比較。結果 術后第1天、7天，與A組比較，B組血清IL-6和TNF-α水平遞增（P<0.05），3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）;與B組比較，C組IL-6和TNF-α水平均降（P<0.05）。結論 DVT大鼠經桃紅四物湯治療后其血清IL-6和TNF-α水平均明顯降低，提示桃紅四物湯對深靜脈血栓的防治療效較好，具有抗凝聚、提高纖溶活性的作用。

〔關鍵詞〕 桃紅四物湯;深靜脈血栓;白介素-6;腫瘤壞死因子-α

〔中圖分類號〕R285.5;R543.6? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.008

Effect of Taohong Siwu Decoction on Serum Levels of IL-6 and TNF-α in a Rat

Model of Acute Deep Venous Thrombosis

LIU Jinghong， LIU Dengyi， CHEN Zhenzhong， LI Leping， CAO Jianxiong*

（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in rats with acute deep venous thrombosis （DVT） of the lower extremities. Methods Eighty male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into four groups： sham-operated group （group A）， DVT model group （group B）， Taohong Siwu Decoction group （group C）， and aspirin group （group D）， with 20 rats in each group. The rats in group A were given open surgery without femoral vein ligation， and then given intragastric administration of saline. The rats in group B were given proximal ligation of the left femoral vein to establish a DVT model， and then given intragastric administration of saline. The rats in group C were given intragastric administration of Taohong Siwu Decoction after proximal ligation of the left femoral vein for establishing the DVT model. The rats in group D were given intragastric administration of aspirin after proximal ligation of the left femoral vein for establishing the DVT model. The intragastric administration in the rats of all groups was withdrawn 7 days later. The serum levels of TNF-α and IL-6 in the four groups were measured by radioimmunoassay before and at 1 and 7 days after operation， and were compared between the four groups. Results Group B had significantly higher serum levels of IL-6 and TNF-α than group A at 1 and 7 days after operation （P<0.05）， and the two proinflammatory cytokines were significantly different between the three time points （P<0.05）. However， group C had significantly reduced serum levels of IL-6 and TNF-α compared with group B after operation （P<0.05）. Conclusion The serum levels of IL-6 and TNF-α in SD rats with acute DVT decrease significantly after intragastric administration of Taohong Siwu Decoction， suggesting that Taohong Siwu Decoction has good efficacy in preventing and treating DVT， with anticoagulant and fibrinolytic activity.

〔Keywords〕 Taohong Siwu Decoction; deep venous thrombosis; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是臨床三大血栓性疾病（心肌梗死、缺血性腦卒中及靜脈血栓）之一，也是臨床上最常見的靜脈疾病之一[1]。急性下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）是臨床常見的外周血管疾病，若治療不及時，易繼發致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全。目前DVT的臨床治療主要以中西醫結合為主[2]。而中醫藥治療DVT不良反應小，安全性高，對促進再通和側支循環的建立都有可靠療效，可以彌補西藥治療溶栓抗凝治療帶來的易致出血的不良反應，以及其量效關系不確切的不足[3]。桃紅四物湯為中醫傳統活血化瘀經典方劑之一， 源自于清·吳謙的《醫宗金鑒》， 由桃仁、紅花、當歸、白芍、熟地黃、川芎6味中藥組成，具有活血化瘀、養血補血的雙重功效。全方養血而不滯血， 活血而不破血， 補中有行， 破中有收， 諸藥合用， 達到活血行氣、扶正祛邪之功效， 在現代中醫臨床被廣泛應用， 且有較好療效。近幾年來現代醫學研究發現炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯系，一方面炎癥促進高凝狀態，另一方面血栓形成中的物質也可引起炎癥。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）與白介素-6（interleukin-6，IL-6）是重要的早期炎癥因子。本研究采用桃紅四物湯對大鼠DVT模型進行干預后，試圖通過檢測血清IL-6和TNF-α水平的變化，研究桃紅四物湯治療深靜脈血栓的作用機制，為中醫藥防治深靜脈血栓形成提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

選用體質量（250±20）g的雄性清潔級SD大鼠80只，16周齡，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2012-0004。隨機分為A、B、C、D 4組，每組20只。

1.2? 藥物試劑與儀器

IL-6和TNF-α ELISA 試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司（IL-6試劑盒產品編：kt40133，TNF-αELISA 試劑盒產品編號：kt30484）。其他相關儀器由湖南中醫藥大學實驗室提供。桃紅四物湯按照《醫宗金鑒》的配比：桃仁20 g，紅花20 g，當歸20 g，熟地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g。依據成人（60 kg）與動物體表面積換算公式得出大鼠等效劑量為7.56 g/kg，桃紅四物湯3次煎煮藥液混合并濃縮至含生藥1.1 g /mL，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥煎劑室提供。阿司匹林腸溶片（批準文號：國藥準字J20130078，安徽仁濟制藥有限公司提供）以生理鹽水配成0.075 mg/mL。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 造模? 各組大鼠常規飼養1周后開始手術造模，予以大鼠腹腔內注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉后，仰臥位固定，常規消毒鋪巾，沿左側下肢股靜脈走行切開皮膚約4.5 cm，暴露、分離左側股靜脈，抽取股動脈血液做檢測標本。A、B、C 3組用4號絲線于暴露的股靜脈近心端結扎股靜脈，結扎線以下1 cm處放置微型血管夾，6 h后拆除結扎線及血管夾，造模完成，無菌縫線縫合手術創口，D組（假手術組）大鼠不予結扎，只將絲線置于血管處，6 h后無菌縫線縫合手術創口。

1.3.2?; 干預措施? 造模術后6 h，肉眼見模型大鼠左下肢腫脹，行彩色多普勒超聲檢查大鼠左下肢靜脈血栓形成，則提示造模成功，造模成功后，立即實施干預措施。假手術組（A組）20只，術后6 h灌胃20 mL/kg生理鹽水;模型組（B組）20只，術后6 h立即灌服20 mL/kg生理鹽水;桃紅四物湯組（C組）20只，術后6 h立即桃紅四物湯濃縮液灌胃給藥，劑量20 mL/kg;阿司匹林組（D組）20只，術后6 h立即灌服阿司匹林腸溶片懸濁液20 mL/kg。以上灌服方法均為每日2 次，持續時間為一周。

1.3.3? IL-6和TNF-α水平檢測? 術后第1天、7天取大鼠動脈血采用ELISA 法檢測血清中IL-6和TNF-α水平，具體操作均按照ELISA試劑盒說明書進行，并于450 nm波長處測定吸光度（OD）值。

1.4? 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以“x±s”表示，同時點4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗;同組內各時點比較采用重復測量資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1? 彩色多普勒超聲檢查DVT組大鼠模型

實驗過程中無大鼠死亡，建模前彩色多普勒超聲檢查提示所有大鼠的左下肢深靜脈通暢、無DVT發生;術后1 d行彩色多普勒超聲檢查提示DVT組大鼠均有左下肢DVT 形成。

2.2? 各組大鼠各時點的血清IL-6和TNF-α水平

術前假手術組、模型組、桃紅四物湯組與阿司匹林組的血清IL- 6水平和TNF-α術前水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）;但術后第1天、7天，與假手術組比較，模型組血清IL- 6和TNF-α水平遞增（P<0.05）;除假手術組外其余3組組內3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組IL- 6、TNF-α水平均降低（P<0.05）。見表1、表2。

3 討論

DVT的形成系指血液在深靜脈腔內不正常地凝結，阻塞靜脈管腔，從而導致靜脈回流障礙，是創傷、手術、癱瘓等之后常發生的并發癥，常好發于下肢。若治療不及時，易繼發致命的肺栓塞和慢性靜脈瓣功能不全。現代醫學研究[4-7]表明，炎癥反應與血栓形成之間存在著密切的聯系，一方面炎癥促進高凝狀態，另一方面血栓形成中的物質也可引起炎癥。IL-6與TNF-α是重要的早期炎癥因子，與創傷后DVT形成[8-9]、創傷后感染[10]、創傷后預后有著密切聯系。中醫學認為DVT是各種原因致瘀血瘀阻脈中，歷代醫家多采用活血化瘀法治療DVT[11]，在臨床上我們發現桃紅四物湯治療效果甚佳。亦有實驗研究[12]表明，桃紅四物湯能顯著延長大鼠體內凝血時間和血栓形成時間，能顯著降低血瘀大鼠全血比黏度、血漿比黏度及血清比黏度，具有較好的活血化瘀作用。桃紅四物湯為中醫活血化瘀經典方劑之一， 源自于清·吳謙的《醫宗金鑒》，由四物湯衍生而來，共有藥物6味，由桃仁、紅花、當歸、赤芍、熟地黃、川芎組成，具有活血化瘀、養血補血的雙重功效。全方養血而不滯血， 活血而不破血， 補中有行， 破中有收， 諸藥合用， 達到活血行氣、扶正祛邪之功效， 在現代中醫臨床被廣泛應用， 且有較好療效。

本實驗通過結扎股靜脈以建立大鼠DVT模型，且用彩色多普勒超聲檢查提示大鼠左下肢DVT建立成功后，立即實施干預措施。術后第1天、7天，與A組比較，B組血清IL-6和TNF-α水平遞增（P<0.05），3個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），說明結扎術導致了DVT的形成及炎癥因子的釋放，炎癥因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用;與B組比較，C組IL-6、TNF-α水平均降低（P<0.05），說明桃紅四物湯能下調TNF-α，IL-6炎癥因子的水平，其機制主要可能是桃紅四物湯藥能有效地抑制TNF-α和IL-6的失控性釋放，清除體內炎癥介質，并可能在一定程度上改善微循環、改善血流動力學、減少炎癥滲出，促進炎癥吸收，從而抑制了DVT 的進一步發展。

綜上，桃紅四物湯能明顯改善炎癥因子IL-6、TNF-α的血清學水平，在一定程度上揭示了其防治深靜脈血栓的作用機制，為臨床實踐及實驗研究提供了實驗基礎和理論依據。深化了中醫藥養血活血法治療DVT的研究，為在中醫辨證論治理論的指導下，應用養血活血等方藥對深靜脈血栓的防治提供較為客觀、科學的數據支持。

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