烏梅丸對胃腸感染模型小鼠血漿Th1、Th2淋巴細胞因子和胃腸傳輸功能的影響

陳志彪 葛俊辰

摘要目的：觀察烏梅丸對胃腸感染模型小鼠的療效，同時探討其對小鼠血漿輔助性T細胞1（Th1）、輔助性T細胞2（Th2）淋巴細胞因子和胃腸傳輸功能的影響。方法：選取昆明小鼠30只并隨機分為空白組、模型組及實驗組，各10只。其中模型組及實驗組小鼠接受致病性大腸桿菌（EPEC）灌胃制作感染性腹瀉模型，空白組用同等劑量生理鹽水灌胃。模型制備成功后實驗組每日用烏梅丸水溶性生物堿灌胃，劑量按照按人/鼠公斤體重的等效劑量換算，空白組及模型組用同等劑量的生理鹽水灌胃，連續干預10 d。比較3組胃排空率、小腸推進率、外周血Th1、Th2淋巴細胞因子表達的變化。結果：模型組及實驗組小鼠外周血白細胞計數、中性粒細胞百分比較空白組升高，差異有統計學意義（P<0.05），其中實驗組較模型組降低（P<0.05）。3組淋巴細胞百分比差異無統計學意義（P>0.05）。模型組及實驗組小鼠的胃排空率及小腸推進率明顯增強，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中實驗組小鼠的胃排空率及小腸推進率明顯較模型組快慢，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組及實驗組小鼠外周血Th2比例、白細胞介素（IL4）、IL6、IL10明顯增高，但實驗組水平低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），模型組及實驗組Th1比例、IL2、腫瘤壞死因子ɑ（TNFɑ）、干擾素γ（IFNγ）表達較空白組明顯升高，但模型組及實驗組之間差異無統計學意義（P>0.05）。結論：烏梅丸可有效改善胃腸感染模型小鼠的胃腸傳輸功能，其作用機制可能與介導機體的體液免疫為主。

關鍵詞胃腸感染模型;胃腸傳輸功能;烏梅丸;輔助性T細胞1;輔助性T細胞2

中圖分類號：R289.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.018

感染性疾病在胃腸道疾病占首要位置，其中大腸桿菌發病率較高。輔助性T細胞1（Th1）、輔助性T細胞2（Th2）是淋巴細胞CD4+T的主要亞群，有研究顯示發生胃腸感染時機體的免疫系統功能受到明顯破壞[12]，其中Th1及Th2的水平變化貫穿疾病的發生發展過程。烏梅丸是《傷寒論》中治療蛔厥的經典方，其君藥烏梅性平味酸澀，入肺腸兩經，有顯著的收斂效應，并可澀腸道生津，臨床不乏其有效治療胃腸道疾病的記載[36]，但其作用機制目前尚無統一定論。基于此，我們利用胃腸感染模型小鼠，探析烏梅丸的部分藥用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取昆明小鼠30只，雌雄各半，購買自濟南金豐實驗動物有限公司（許可證號：SCXX（滬）201100241），本研究方案經過本院倫理委員會批準進行，所有動物飼養于本院動物實驗中心，飼養條件：溫度（23.5±0.5）℃濕度（52±1.5）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2藥物烏梅丸粉由本院中藥研究院提供，組成：烏梅300枚，細辛84 g、干姜140 g、黃連224 g、當歸56 g、附子84 g（去皮，炮）、??????? 蜀椒56 g（出汗）、桂枝84 g（去皮）、人參84 g、黃柏84 g，以上10味，各搗篩，混合和勻;以苦酒漬烏梅12 h，去核，蒸熟搗成泥，與蜜組成丸。

1.1.3試劑與儀器致病性大腸桿菌（EPECE2348/69）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，烏梅丸粉由本院中藥研究院提供，小鼠T淋巴細胞因子CBA試劑盒購自北京西美杰科技有限公司，CytoFLEX LX流式細胞儀購自貝克曼庫爾特商貿有限公司，血細胞分析儀購自北京寶靈曼陽光科技有限公司。白細胞介素2（IL2）、IL6、IL10、IL4、腫瘤壞死因子ɑ（TNFɑ）、干擾素γ（IFNγ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備

選取昆明小鼠30只，隨機分為空白組、模型組及實驗組，各10只。3組小鼠在體重、鼠齡比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。參考文獻[7]中EPEC致胃腸感染模型制備方法，使用0.3 mL的3%碳酸氫鈉溶液對模型組及實驗組小鼠進行灌胃，30 min后將事先配制好的濃度為5×108cfu/mL的致病性EPEC混懸液再次灌胃，每只小鼠灌胃0.5 mL致病性EPEC混懸液，隨后回籠飼養，觀察小鼠的大便變化情況。空白組小鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃后回籠飼養。灌胃6 h后小鼠出現精神疲乏、活動減少、大便性狀改變提示造模成功。

1.2.2干預方法

實驗組小鼠造模成功后每日灌胃烏梅丸水溶液，劑量按人/鼠公斤體重的等效劑量計算，1次/d，連續干預10 d。模型組及空白與等體積蒸餾水灌胃。

1.2.3檢測指標

1）胃排空率、小腸推進率：將3組小鼠禁食12 h，按照0.1 mL/10 mg的比例計算活性炭劑量，將計算好的活性炭進行灌胃，隨后處死小鼠取胃稱重。將胃置于冰上后從胃大彎處剪開胃體，用生理鹽水沖洗胃內容物后再次稱重，計算胃排空率。再剪取腸管測量小腸總長度，從幽門至活性炭前沿的距離視為腸管內推進距離，計算小腸推進率。

2）Th1及Th2淋巴細胞因子的表達：干預結束取3組小鼠眼眶靜脈血，分離出單核細胞，將分離出的單核細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養4～6 h，培養過程中加入佛波醇乙酯（PMA）及離子霉素、莫能霉素混合而成的工作液體進行刺激，隨后將細胞收集后加人5 μL異硫氰酸熒光素標記的CD4（CD4FITC），操作按試劑盒說明書進行，采用流式細胞儀檢測Th1及Th2細胞。

3）IL4、IL2、IL6、IL10、TNFɑ、IFNγ檢測：在4 ℃條件下進行3 000×g離心5 min后用高壓槍頭吸取離心后的上清液，使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）進行檢測，利用抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合原理進行相關因子濃度的檢測，具體步驟如下：用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL緩沖液，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，3 min/次。將一定稀釋的待檢樣品0.1 mL加入反應孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。隨后在各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。再于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。試劑盒由廣州達安基因股份有限公司提供，顯色后采用492 nm波長，TMB反應產物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統調零，用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值（P/N）表示。以空白對照孔調零后測各孔A值，若大于規定的陰性對照A值的2.1倍，即為陽性。操作過程全部按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行研究數據分析。所得數據都用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用秩和檢驗;組內比較采用配對秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.13組血細胞比較

模型組及實驗組小鼠外周血白細胞計數、中性粒細胞百分比較空白組升高，差異有統計學意義（P<0.05），其中實驗組較模型組降低（P<0.05）。3組淋巴細胞百分比比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.23組胃排空率及小腸推進率比較

模型組及實驗組小鼠的胃排空率及小腸推進率明顯增強，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中實驗組小鼠的胃排空率及小腸推進率明顯較模型組慢，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.23組Th1及Th2比例比較

模型組及實驗組小鼠外周血Th2比例、IL6、IL10、IL4與空白組比較明顯增高，但實驗組水平低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），模型組及實驗組Th1比例、IL2、TNFɑ、IFNγ表達較空白組明顯升高，但模型組及實驗組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3～4。

3討論

目前關于胃腸感染動物模型制備方法的報道不多，主要以大腸桿菌誘導為主，主要以腹腔注射誘導動物腹瀉，但此類模型與人類感染大腸桿菌實際情況不符，故本研究采用經口灌胃途徑建立胃腸道感染動物模型，與人類經口感染方式更為貼近。在本研究中我們對20只昆明小鼠進行模型制備，結果顯示在造模6 h后小鼠均出現精神疲乏、活動減少、大便性狀等表現，這提示本研究的造模是成功。我們認為小鼠在感染大腸桿菌后腸道黏膜組織受破壞，腸道黏膜組織上皮細胞完整性受損，隨著細菌的侵入局部組織滲出增多，從而導致小鼠大便性狀改變（主要以出現黏液稀便為主）、精神萎靡等炎性反應表現。

我們參考文獻[7]方法進行造模，首先灌胃碳酸氫鈉溶液，旨在盡可能減少小鼠腸道活動能力，保持腸內容物、營養物質的存留，抑制胃酸分泌，降低胃腸道的屏障功能，促進大腸桿菌定殖，并進一步粘附于胃腸道內，導致胃腸道組織的損傷，誘發其免疫反應的發生，從而出現腹瀉的癥狀。白細胞是機體抵御外界細菌感染的重要防線，本研究發現，接受大腸桿菌定植的模型組及實驗組小鼠血漿中白細胞及中性粒細胞百分比均較空白組升高，這進一步證實了小鼠成功受到細菌的感染，而在研究中我們發現3組小鼠淋巴細胞百分比數值相似，差異無統計學意義，這亦佐證小鼠并未受到病毒感染。

小鼠受到大腸桿菌侵襲后腸道黏膜及全身免疫系統快速啟動應答，募集大量的細胞因子參與反應，其中包括Th1淋巴細胞及其代表細胞因子IL2、TNF、IFNγ，以及Th2淋巴細胞及其代表細胞因子IL6、IL10、IL4。Th1淋巴細胞及Th2淋巴細胞在機體免疫應答過程中占據重要位置，有研究指出，機體發生胃腸感染后（細菌感染及病毒感染）炎性反應遞質產生明顯變化，其中IL6尤為突出[810]。在本研究中我們發現模型組及實驗組小鼠血漿IL6的確較空白組升高，IL6有多種功能，其水平升高可抑制B淋巴細胞增殖及分泌相應抗體，從而減弱抗體抗原結合反應，阻礙病原體的清除。IL4亦可激活B淋巴細胞，從而促進IgE及IgG進一步分泌，同時還可促進IgG向IgE轉換，從而破壞腸道微生物的生態平衡，進而影響腸道免疫耐受功能，加重腹瀉癥狀[1112]。有數據證實IL2可通過促進了各亞型T細胞活化而廣泛參與機體各種炎性反應的發生發展過程。有研究通過動物模型研究發現，葡萄球菌腸毒素感染后動物體內IL10水平上調，這與本研究結果基本一致，IL10單抗可明顯提升葡萄球菌腸毒素注射小鼠的死亡率，IL10是腸道黏膜重要的免疫應答因子，其水平的不斷提升可導致炎性反應的不斷擴大及延展。本研究結果發現大腸桿菌制備的胃腸感染模型小鼠體內Th1及Th2細胞及其代表性因子均產生了變化，這提示通過大腸桿菌制備的胃腸感染模型小鼠體內并非單純促炎/抗炎表現，亦并非單純的Th1類細胞或Th2類細胞活化，而是產生了混合型的免疫應答效應，且以Th2為代表的體液免疫表現為主，這與國內研究結果相似[7]。

中醫并無胃腸感染病名記載，其屬于“腹瀉、泄瀉”等范疇，外邪導致臟腑陰陽失調，痰瘀互結侵襲腸腑而成此病，以腹痛、大便稀溏、疲乏等為主要臨床表現，“脾虛邪戀、濕熱下注、腸道失固”是其主要病機，因此攻補兼顧、寒溫并行是治療本病的關鍵。烏梅丸是《傷寒論》中治療蛔厥的經典方，由烏梅、干姜、細辛、當歸、桂枝、人參、黃柏、黃連、附子、花椒等10味中藥組合而成[1314]。其中君藥烏梅性平味酸澀，入肺腸兩經，有顯著的收斂效應，并可澀腸道生津;花椒、細辛、桂枝、附子、干姜散寒溫中，黃連、黃柏清熱除煩、滋腎止渴，人參、當歸益氣補血活血，調節脾胃之氣而生血和血。現代藥理研究顯示，烏梅丸有抗菌、消炎、抗變態反應的作用[1520]，同時還有修復腸道黏膜以抑制有毒物質破壞腸道組織的作用。整方寒熱并用、補瀉兼施、邪正兼顧。本研究結果顯示，加用烏梅丸的實驗組小鼠在改善血細胞分布、免疫應答、抑制炎性反應方面均有顯著提升，這提示烏梅丸確可效改善胃腸感染模型小鼠的胃腸傳輸功能，其作用機制可能與介導機體的體液免疫為主。

參考文獻

[1]Chandra BK，Singh G，Taneja N，et al.Diarrhoeagenic Escherichia coli as a predominant cause of paediatric nosocomial diarrhoea in India[J].J Med Microbiol，2012，61（Pt 6）：830836.

[2]Alikhani MY，Sedighi I，Zamani A，et al.Incidence of diarrhoeagenic Escherichia coli isolated from young children with diarrhoea in the west of Iran[J].Acta Microbiol Immunol Hung，2012，59（3）：367374.

[3]李娜.新加烏梅丸治療腹瀉型腸易激綜合征29例臨床觀察[J].河北中醫，2014，36（1）：5253.

[4]梅剛，漆冬梅.烏梅丸治療糖尿病性腹瀉50例臨床觀察[J].云南中醫中藥雜志，2010，31（1）：4344.

[5]袁方.烏梅丸加減治療腹瀉型腸易激綜合征46例[J].光明中醫，2010，25（8）：13841385.

[6]倪樹文，孫金蟬.烏梅丸丸治療寒熱錯雜腹瀉型腸易激綜合征的臨床研究[J].中醫藥通報，2014，13（2）：5355，58.

[7]陳超，鄭成中.致病性大腸桿菌胃腸感染小鼠模型血漿Th1、Th2、Th17淋巴細胞因子變化及意義[J].中國醫藥導報，2013，10（19）：3739.

[8]楊立華，傅曉鳳，潘傳四，等.細胞炎前因子測定對感染性腹瀉診斷的價值[J].實用兒科臨床雜志，2007，22（1）：1515，44.

[9]熊文虹，杜華，李柳青.急性感染性腹瀉患兒血清細胞因子測定的臨床意義[J].臨床兒科雜志，2002，20（7）：439.

[10]Ko G，Jiang ZD，Okhuysen PC，et al.Fecal cytokines and markers of intestinal inflammation in international travelers with diarrhea due to Noroviruses[J].J Med Virol，2006，78（6）：825828.

[11]Florquin S，Amraoui Z，Goldman M.Persistent production of TH2type cytokines and polyclonal B cell activation after chronic administration of staphylococcal enterotoxin B in mice[J].J Autoimmun，1996，9（5）：609615.

[12]Rennick DM，Fort MM.Lessons from genetically engineered animal models.XII.IL10deficient（IL10（-/-）mice and intestinal inflammation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，278（6）：G829833.

[13]陳燁文，連建偉，龔一萍.論葉天士及《溫病條辨》對烏梅丸方的發揮[J].中華中醫藥雜志，2015，30（5）：16071609.

[14]王璐，張紅宇，王莉.烏梅及其不同炮制品的藥理作用比較[J].中藥材，2010，33（3）：353356.

[15]楊瑩菲，胡漢昆，劉萍，等.烏梅化學成分、臨床應用及現代藥理研究進展[J].中國藥師，2012，15（3）：415418.

[16]趙凱英.細辛不同用量配伍應用舉隅[J].長春中醫藥大學學報，2009，25（6）：966966.

[17]費可，胡瑕瑜，鄒璐，等.細辛臨床應用與藥理作用研究進展[J].上海中醫藥大學學報，2010，24（6）：8790.

[18]劉芳，謝鳴，朱麗瑤.烏梅丸現代主治病證的研究[J].北京中醫藥大學學報：中醫臨床版，2011，18（4）：3740.

[19]楊梅，柳華，代二慶.烏梅丸治療消化系統疾病應用概述[J].天津中醫藥大學學報，2015，34（2）：125128.

[20]陳潔生.四君子湯聯合腸內營養支持促進胃癌術后恢復臨床研究[J].吉林中醫藥，2013，33（4）：383385.

（2018-08-31收稿責任編輯：芮莉莉）