液相色譜系統梯度延遲體積測算方法

李泓文，聶大林

（蘇州賽譜儀器有限公司，江蘇 蘇州 215200）

0 引言

賽譜儀器的SCG 蛋白純化系統是液相色譜儀器（LC）中的一種，基本原理和HPLC 類似，本文介紹的梯度延遲體積測算方法將搭配賽譜儀器SCG 蛋白純化系統中的UV 檢測器使用。該檢測器為光二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD），波長范圍200nm ～800nm，可同時檢測4 個波長，它采用鎢燈與氘燈組合光源，從光學上把兩個光源結合在一起，復合光經衍射光柵色散后投射到1024 個二極管組成的二極管陣列上被檢測，其光路圖如圖1 所示。

本次測算的對象是北京衛星制造廠在科技部重大專項《高精度超高壓液相泵的開發與應用》（項目編號：2016YFF0101000）項目中研制的高精度超高壓液相泵（UHPLC-BSC-02 型），以及SCG 蛋白純化系統中的色譜泵。

1 梯度洗脫

進行高效液相色譜分析時，常采用兩種洗脫方式，一種為等度洗脫（isocratic elution），另一種為梯度洗脫（gradient elution）[1]。

用等度洗脫進行色譜分離，由不同溶劑構成的流動相組成，如流動相的極性、離子強度、pH 等，在分離的全過程中皆保持不變。用梯度洗脫進行色譜分離時，在洗脫過程中含兩種或兩種以上不同極性溶劑的流動相組成會連續或間歇地改變，期間可調節流動相的極性，改善樣品中各組份間的分離度。梯度洗脫一般是指流動相組成隨分析時間的延長呈線性變化，即線性梯度洗脫[1]。

梯度系統可分為低壓梯度系統和高壓梯度系統，不同系統的延遲體積取決于泵的設計。低壓梯度系統通過控制比例閥的開閉時間，而高壓梯度系統通過控制泵的流量實現梯度洗脫[3]。在四元低壓梯度系統中梯度混合在比例閥處進行，在混合器、管路、比例閥均相同的條件下，該閥造成的延遲體積通常比二元高壓梯度系統的延遲體積更大，本文測試均為高壓梯度系統。

2 梯度延遲體積及影響

色譜分離效果受色譜系統等諸多因素影響，尤其在不同設備之間復制梯度洗脫方法時可能會表現出明顯差異。

梯度延遲體積是色譜系統的重要特征參數，是指從溶劑配比完成點到色譜柱頭的系統體積，主要來源是泵、壓力傳感器、混合器以及連接管路。

實際觀測到的梯度洗脫會向后平移一段時間，稱為梯度洗脫的延遲時間，如圖2（a）所示。在梯度洗脫開始與結束處的輪廓線理論上應為直線，但實際上由于梯度系統中的延遲體積導致系統內擴散，直線則變成了圓滑的線，這就使梯度洗脫的線性變差如圖2（b）所示[1]。

圖2 線性梯度輪廓Fig.2 Linear gradient profile

圖3 二元高壓梯度系統中的梯度延遲體積Fig.3 Gradient delay volume in a binary highpressure gradient system

傳統HPLC 系統延遲體積一般在0.5mL ～5mL 范圍，通常采用4.6mm 內徑，150mm 或更長的色譜柱，分析時間10min ～20min 之間或更長時，延遲體積影響并不顯著。但是隨柱長變短，內徑變細，較大的延遲體積可能會引起保留時間明顯增加，色譜分離情況發生變化。因此，應選延遲體積小的液相色譜儀以適應梯度試驗，二元高壓梯度系統中延遲體積如圖3 所示[2]，四元低壓梯度系統中的梯度延遲體積如圖4 所示。

梯度方法開始后，在梯度溶液通過延遲體積前色譜柱內的流動相尚未改變。在此期間，色譜柱處于等強度洗脫過程中，在不同設備間復制梯度洗脫方法時需要謹慎。即便是在同一根色譜柱上用相同的方法操作色譜過程，延遲體積如果有變化，樣品保留時間很可能也會改變。除此之外，較小的延遲體積也有利于色譜系統快速更換溶劑，同時更適于梯度洗脫。

圖4 四元低壓梯度系統中的梯度延遲體積Fig.4 Gradient delay volume in a quaternary low-pressure gradient system

1）環境條件：環境溫度18 ℃～30 ℃，環境濕度≤75%。

2）流動相：A 二次蒸餾水，B0.4%丙酮。

3） 設 備： 泵1 套，UV 檢 測 器1 套，1/16PFA 管*15cm，注射器1 支，精密天平1 臺。

3 梯度延遲體積測算

3.1 測算原理

大多液相色譜系統從流動相開始至色譜柱柱頭會有泵、壓力傳感器、混合器、樣品選擇模塊、進樣模塊、背壓閥、排空閥、過濾器等。計算其內部腔體體積及管路，接頭體積非常復雜，且所有部件的加工精度誤差實際存在且無法被有效計算，在超高壓系統下可能還需將壓力因素考慮在內。已知的直接稱重法、使用非保留化合物法、同位素標記淋洗液中組份法、局部干擾法，無機鹽法以及同族線性化法均不能可靠測量延遲體積[4]。

本方法先將連接至色譜柱柱頭的管路直接連接至賽譜儀器SCG 蛋白純化系統的UV 流通池，使用0.4%丙酮溶液泵入系統直至充滿并得到吸光度V1，再用流動相選擇閥將流動相切換至純水，沖出系統內的0.4%丙酮溶液直至吸光度歸零，同時用注射器收集此階段所有混合液并稱量質量M，然后將混合液再次泵入系統直至吸光度穩定至V2，最后使用測試過程中得到的V1，V2 和M 計算出0.4%丙酮溶液的質量即可算出從流動相選擇閥開始至色譜柱柱頭的全部體積，流動相選擇閥至泵入口的管路因為是在泵前幾乎不受壓力的影響可以直接根據管路長度和內徑計算出該段體積并扣除，剩下部分即為延遲體積。本方法排除了上述的機械加工誤差以及高壓因素的影響，在UV 檢測器線性范圍內均能準確測量延遲體積且方法靈活，可以根據實際需要增加或減少被測管路和部件，例如在不扣除泵前管路的情況下即可算出樣品加載體積。

圖5 梯度延遲體積測算方法示意圖Fig.5 Schematic diagram of the gradient delay volume measurement method

3.2 操作步驟

◇正確連接儀器后開機，檢測器波長設置為254nm，預熱0.5h。

◇流動相選擇閥CTR 連接進樣泵，S1 連接二次蒸餾水，S2 連接0.4%丙酮溶液，泵出液口連接檢測器流通池，流通池出液口連1/16PFA 管*15cm。

◇流動相選擇閥通道選擇S2，手動運行流速5ml/min，確認管路充滿丙酮溶液且無氣泡，待UV 吸光度平穩后記錄一段平穩的吸光度平均值V1。

◇將注射器清洗干凈并擦干后放置于精密天平，待數值穩定后按下“去皮”按鈕，數值顯示為零后取回注射器備用。

◇取下1/16PFA 管，排出液體后重新接回，并將PFA管出液口連接至注射器。

◇流動相選擇閥通道選擇S1，手動運行流速5ml/min，待注射器中收集混合液（管路中剩余的丙酮溶液+通道S1的二次蒸餾水）約10ml 時暫停，將注射器放置于精密天平，記錄天平顯示值M。

◇取回注射器，將流動相選擇閥S1 通道連接注射器，手動運行流速5ml/min，待UV 吸光度平穩后記錄一段平穩的吸光度平均值V2。

◇重復以上步驟3 次，將V1，V2，M 值填入表1 得出加載體積L，并計算L 的平均值作為加載體積。圖5 為方法示意圖。

式（1）中，ρ——丙酮溶液和二次蒸餾水混合液密度，默認為1。

表1 賽譜儀器液相泵延遲體積計算Table 1 Calculation of liquid phase pump delay volumeof game Sepure Instrument

3.3 測算結果

本方法原理與梯度準確度測試原理相似，在泵流速和UV 檢測器線性良好的前提下，使用本方法對賽譜儀器液相泵和國產高精度超高壓液相泵的梯度延遲體積進行測算，結果見表1 和表2（以下體積數據均已扣除泵前管路0.456ml）。

4 結論

通過將國產高精度超高壓液相泵與賽譜儀器液相泵分別用該方法測算梯度延遲體積，從測算結果可知該梯度延遲體積測算方法具有良好的重復性，且根據實際情況可以用于大多數液相系統的延遲體積、泵死體積、樣品泵加載體積、柱外死體積等測量。

表2 國產高精度超高壓液相泵延遲體積計算Table 2 Delay volume calculation of domestic high-precision ultra-high pressure liquid pump