NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎發病過程中的作用機制

隋方宇　姜德友　韓潔茹　周雪明　趙銘宇　解穎

摘要 目的：探討NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎（GA）發病過程中的作用機制。方法：選取慢病毒轉染技術干擾NALP6蛋白的基因表達，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質印跡法（Western blotting）、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）等技術檢測細胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表達情況;結果：干擾成纖維滑膜細胞中NALP6基因的表達，能減低痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞中NALP6蛋白的表達、降低caspase-1和核因子-κB的活性，降低IL-1β含量;結論：NALP6炎性反應信號轉導通路參與了大鼠痛風性關節炎的發病過程，通過能夠干擾NALP6基因表達的慢病毒轉染技術能保護痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞的炎性損傷。

關鍵詞 痛風性關節炎;NALP6信號轉導通路;caspase-1;白細胞介素-1β;核因子-κB;慢病毒轉染;成纖維樣滑膜細胞;靶點

Study on the Mechanism of NALP6 Signal Transduction Pathway in the Pathogenesis of Gout Arthritis

Sui Fangyu1，Jiang Deyou1，Han Jieru1，Zhou Xueming1，Zhao Mingyu2，Xie Ying1

（1 Basic Medicine Collage，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Department of Gynecology，Heilongjiang Hospital of TCM，Harbin 150036，China）

Abstract Objective：To investigate the action mechanism of the NALP6 signal transduction pathway involved in gout arthritis（GA）.Methods：The lentiviral transfection technology was used to interfere the expression of NALP6 gene and the expression of NALP6，caspase-1，IL-1β and NF-κB was detected by using Elisa，Western Blot and RT-PCR technology.Results：Interfering the expression of the NALP6 genes could reduce the expression levels of NALP6 protein and RNA and NF-κB protein，the activity of caspase-1 and the content of IL-1β in fibroblast-like synoviocytes.Conclusion：1）The study confirmed that the NALP6 signal transduction pathway is involved in the pathogenesis process of GA in rats and revealed that the inflammatory signal of “NALP6-caspase-1-IL-1β” and the cycle pathway of inflammatory cascade between IL-1β and NF-κB play an important role in the process of gouty arthritis.2）The method of interfering the genes expression of NALP6 by lentiviral transfection technology can protect the inflammation injury of fibroblast-like synoviocytes.3）Regarding NALP6 as a target may provide a new idea for clinical prevention and treatment of gouty arthritis.

Key Words Gouty arthritis; NALP6; caspase-1; IL-1β; NF-κB; Lentiviral transfection; Fibroblast-like synoviocytes; Target

中圖分類號：R229;R593文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.011

NALP6炎性反應體可以誘導caspase-1的活化并且能夠參與核因子-κB的調控，進而參與炎性反應的過程。但是，NALP6是否在痛風性關節炎（GA）發病機制中起一定的作用，尚未見報道。因此，我們采用大鼠成纖維樣滑膜細胞制成GA模型，運用慢病毒轉染技術干擾NALP6基因的表達，通過觀察NALP6、caspase-1、白細胞介素（IL）-1β和核因子-κB的表達情況，探討NALP6炎性信號通路在GA發病過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

選取10周齡健康雄性SD大鼠成纖維樣滑膜細胞（萬類生物科技公司提供）。

1.1.2 儀器

慢病毒轉染使用儀器和試驗。見表1，2。NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎發病過程中的作用機制研究儀器和試驗。見表3，4。

1.1.3 試劑

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1）慢病毒轉染分組：選取空白組、空轉染慢病毒載體對照組、NALP6干擾表達慢病毒載體組。

2）NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎發病過程中的作用機制研究分組：每3孔為一組，共分為4組：a.空白組：正常滑膜細胞;b.模型組：滑膜細胞+尿酸鈉;c.模型空轉染組：滑膜細胞+尿酸鈉+空轉染慢病毒載體;d.模型NALP6轉染組：滑膜細胞+尿酸鈉+NALP6干擾慢病毒載體。

模型制備：將大鼠成纖維樣滑膜細胞進行原代培養并留取第三代細胞用于后續實驗，加入MSU溶液制備成痛風性關節炎模型。

1.2.2 檢測指標與方法

1）慢病毒轉染：通過ddCt RQ（Relative Quantitation）以擴增公式2-△△Ct對NALP6的表達量進行分析計算。

2）NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎發病過程中的作用機制研究：采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質印跡法（Western blotting）、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）等技術檢測細胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表達情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。如果數據資料滿足正態性和方差齊性，則應用單因素方差分析;如不滿足上述條件則采用非參數檢驗方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組慢病毒轉染比較

與空白組比較，空轉染慢病毒載體空白組NALP6表達無明顯變化，NALP6干擾表達慢病毒載體組的NALP6表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5。

2.2 NALP6信號轉導通路在痛風性關節炎發病過程中的作用機制

2.2.1 各組滑膜細胞中IL-1β含量的變化

與空白組比較，模型組細胞中IL-1β含量明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉染組細胞內IL-1β含量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表6。

2.2.2 各組滑膜細胞中caspase-1活性

與空白組比較，模型組細胞中caspase-1活性明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉染組細胞內caspase-1活性下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表7。

2.2.3 各組滑膜細胞中NALP6蛋白表達比較

與模型組比較，模型NALP6轉染組細胞內NALP6蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），經慢病毒轉染干擾NALP6基因表達能夠降低痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞中NALP6蛋白的表達。見圖1。

2.2.4 各組滑膜細胞中核因子-κB蛋白表達比較

與空白組比較，模型組細胞中核因子-κB蛋白表達明顯升高;與模型組比較，模型NALP6轉染組細胞內核因子-κB蛋白表達下降，差異有統計學意義（P<0.05），經慢病毒轉染干擾NALP6基因表達能夠降低痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞中核因子-κB蛋白的表達。見圖2。

2.2.5 各組滑膜細胞中IκB蛋白表達比較

與空白組比較，模型組細胞中IκB蛋白表達明顯降低;與模型組比較，模型NALP6轉染組細胞內IκB蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.05），經慢病毒轉染干擾NALP6基因表達能夠升高痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞中IκB蛋白的表達。見圖3。

2.2.6 各組滑膜細胞中NALP6mRNA表達情況

與空白組比較，模型組細胞中NALP6mRNA表達明顯升高（P<0.05）;與模型對照組比較，模型NALP6轉染組細胞內NALP6mRNA表達下降，差異有統計學意義（P<0.05），經慢病毒感染干擾NALP6基因能夠降低痛風性關節炎成纖維樣滑膜細胞中NALP6mRNA的表達。見表8。

3 討論

GA是一種自身炎性疾病[1]，其發病機制非常復雜，細胞外的尿酸濃度過飽和形成微晶尿酸鈉（MSU）晶體，刺激一系列細胞因子、趨化因子的釋放，進而引起了關節的疼痛、腫脹、痛風石形成等炎性反應[2]。因而MSU晶體是痛風發病機制中的啟動因素。雖然MSU晶體在痛風的發病機制中其作用已經闡明，但在滑膜細胞內MSU作為一個危險信號如何與免疫系統相互作用有待進一步研究。本實驗屬于導師國家自然科學基金項目課題中的一部分研究[3-7]，本課題組前期在miR芯片篩選實驗已經證實了NALP6參與了GA的發病過程，但其機制尚不明確，這也是本實驗研究的重點內容。

痛風性關節炎發病機制以IL-1β級聯的炎性反應為特征[8]。大鼠滑膜細胞慢病毒轉染實驗顯示，MSU刺激的GA滑膜細胞內NALP6表達上調，炎性反應遞質caspase-1活性，IL-1β含量以及核因子-κB表達均顯著增高，與NALP6表達正相關，提示NALP6參與了痛風性關節炎的發生。通過轉染沉默NALP6蛋白表達的慢病毒感染過程，能明顯降低caspase-1活性、IL-1β含量以及核因子-κB表達，提示NALP6可以正調控炎性反應遞質caspase-1、IL-1β等。因此推測NALP6對caspase-1及核因子-κB有正調控作用。

痛風性關節炎的大鼠體外研究表明，尿酸鈉鹽被滑膜表面或胞內的模式識別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）識別，誘導NAPL6形成炎性復合體[9-10]，從而活化caspase-1，剪切pro-IL-1β，產生成熟的IL-1β，IL-1β活化IL-1R[11-15]，激活核因子-κB。上述一系列反應釋放大量細胞因子、趨化因子等引發痛風性關節炎的炎性反應。組織表現為局部充血、水腫、大量炎性反應細胞浸潤、纖維素滲出，同時沉積部位出現組織凝固性壞死，結締組織細胞間質纖維變性。我們借助慢病毒轉染技術證實，沉默NALP6表達能降低NALP6炎性反應體激活的能力，影響caspase-1的生成，降低某些炎性反應遞質（IL-1β和IL-18）產生，從而抑制痛風性關節炎的發生。

綜上所述，NALP6蛋白信號轉導通路在GA中起重要作用，對NALP6的表達進行抑制，可明顯抑制caspase-1的活性和IL-1β的含量，可為臨床防治GA提供新靶點。

參考文獻

[1]汪學良，劉念，秦天楠，等.痛風研究現狀及展望[J].風濕病與關節炎，2018，7（6）：68-70，80.

[2]周蜜，王一飛，袁佳沁，等.急性痛風性關節炎免疫學發病機制研究進展[J].世界臨床藥物，2018，39（11）：779-782.

[3]姜德友，李文昊，解穎，等.補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清IL-17表達水平的影響[J].世界中醫藥，2015，10（10）：1574-1577.

[4]姜德友，鄒麗，隋方宇，等.補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清MMP-7影響的實驗研究[J].吉林中醫藥，2015，35（12）：1264-1267.

[5]姜德友，曲曉雪，陳飛，等.補腎利濕法對痛風性關節炎大鼠超氧化物歧化酶表達的影響[J].湖北中醫藥大學學報，2016，18（1）：11-14.

[6]隋方宇，韓潔茹，周雪明，等.補腎利濕法中藥復方對大鼠痛風性關節炎NALP6信號傳導通路調控作用的研究[J].上海中醫藥雜志，2019，53（2）：81-85.

[7]姜德友，馮濤，陳飛，等.補腎利濕法對大鼠痛風性關節炎MMP3、Caspase-5表達的影響[J].陜西中醫，2016，37（6）：752-753.

[8]Torres R，Macdonald L，Croll SD，et al.Hyperalgesia，synovitis and multiple biomarkers of inflammation are suppressed by interleukin 1 inhibition in a novel animal model of gouty arthritis[J].Ann Rheum Dis，2009，68（10）：1602-1608.

[9]Grenier JM，Wang L，Manji GA，et al.Functional screening of five PYPAF family members identifies PYPAF5 as a novel regulator of NF-kappaB and caspase-1[J].FEBS Lett，2002，530（1-3）：73-78.

[10]Wang L，Manji GA，Grenier JM，et al.PYPAF7，a novel PYRIN-containing Apaf1-like protein that regulates activation of NF-kappa B and caspase-1-dependent cytokine processing[J].J Biol Chem，2002，277（33）：29874-29880.

[11]Kanneganti TD.Central roles of NLRs and inflammasomes in viral infection[J].Nat Rev Immunol，2010，10（10）：688-698.

[12]Van Gorp H，Kuchmiy A，Van Hauwermeiren F，et al.NOD-like receptors interfacing the immune and reproductive systems[J].FEBS J，2014，281（20）：4568-4582.

[13]Kanneganti TD，Ozren N，Body-Malapel M，et al.Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase-1 through cryopyrin/Nalp3[J].Nature，2006，440（7081）：233-236.

[14]Anand PK，Malireddi RK，Kanneganti TD.Role of the nlrp3 inflammasome in microbial infection[J].Front Microbiol，2011，2：12.

[15]Lupfer C，Thomas PG，Anand PK，et al.Receptor interacting protein kinase 2-mediated mitophagy regulates inflammasome activation during virus infection[J].Nat Immunol，2013，14（5）：480-488.

（2018-07-04收稿 責任編輯：楊覺雄）