出芽短梗霉菌PA-2發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

楊瑩 莊新亞 程亮 郭青云

摘要：【目的】?jī)?yōu)化出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）PA-2菌株產(chǎn)孢發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，以提高PA-2菌株的產(chǎn)孢量，為該菌的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。【方法】以PA-2菌株發(fā)酵液中的產(chǎn)孢量為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因子優(yōu)化PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design， CCD）篩選培養(yǎng)基成分最佳配比;用PA-2菌株制成可濕性粉劑用于雜草藜田間防除試驗(yàn)。【結(jié)果】經(jīng)優(yōu)化后，PA-2菌株產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖84.60 g/L、大豆粉46.35 g/L、NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、（NH4）2SO4 0.52 g/L;最佳發(fā)酵條件為pH 7、溫度25 ℃、裝液量60 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量8%、培養(yǎng)時(shí)間120 h。田間防除試驗(yàn)結(jié)果表明，PA-2可濕性粉劑對(duì)雜草藜的鮮重防效最高可達(dá)75.0%。【結(jié)論】?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)和發(fā)酵條件可有效提高PA-2菌株的產(chǎn)孢量，降低發(fā)酵成本，適合發(fā)酵放大試驗(yàn)及相關(guān)劑型的開(kāi)發(fā)研究;可采用PA-2菌株生產(chǎn)菌劑應(yīng)用于雜草防除。

關(guān)鍵詞： 出芽短梗霉菌PA-2;產(chǎn)孢量;發(fā)酵條件;單因子優(yōu)化;田間試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)： S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? ? ?文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-1998-11

Abstract：【Objective】In order to improve Aureobasidium pullulans PA-2 spore production and provide theoretical references for its exploitation and application， medium composition and fermentation conditions of PA-2 were optimized.【Method】Spore production in fermentation broth of PA-2 strain were set as test indexes. Single factor experiments were used to determine the optimum basic medium and fermentation conditions. The optimum formulation of fermentation medium was determined by central composite design（CCD）. The wettable powder made by PA-2 was used to conduct field control test of Chenopodium album. 【Result】The optimal medium composition for PA-2 strain spore production were：Glucose 84.60 g/L， soybean powder 46.35 g/L， NaCl 2.59 g/L， MgSO4 0.52 g/L， KCl 0.78 g/L， K2HPO4 6.50 g/L， （NH4）2SO4 0.52 g/L. The optimal fermentation conditions were：initial pH 7， culture temperature 25 ℃，liquid volume 60 mL/250 mL， rotation speed 180 r/min，inoculation amount 8%， and fermentation for 120 h. The results of field control experiment showed that the fresh weight effect of PA-2 wettable powder on C. album reached 75.0%. 【Conclusion】The optimized medium and fermentation conditions enhance the spore production of A. pullulans PA-2， lower the fermentation cost， and are suitable for development of fermentation scale-up test and related dosage forms. PA-2 can be used to produce microbial ino-culum for weed control.

Key words： Aureobasidium pullulans PA-2; spore yield; fermentation conditions; single factor optimization;field experiment

0 引言

【研究意義】田間雜草是作物病蟲(chóng)害發(fā)生和傳播的介質(zhì)，雜草增加了農(nóng)業(yè)田間管理勞動(dòng)和投入成本，成為嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的因素之一（李久新，2011;陳世國(guó)和強(qiáng)勝，2015;李香菊，2018）。化學(xué)除草劑的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致農(nóng)田雜草抗藥性迅速發(fā)展，作物藥害、農(nóng)藥殘留發(fā)生頻繁，增加了雜草治理的難度和人工費(fèi)用（馮維卓和吳建良，2001;梁巧玲和馬德英，2007）。因此，研究高效、綠色、無(wú)污染的生物農(nóng)藥以增加除草藥劑的豐富度，避免單一藥劑的長(zhǎng)期使用造成雜草抗藥性已成為當(dāng)前雜草防除研究的熱點(diǎn)。出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）是一類(lèi)與酵母密切相關(guān)的真菌，目前針對(duì)出芽短梗霉菌研究報(bào)道最多的是通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件優(yōu)化增加出芽短梗霉菌產(chǎn)生的糖類(lèi)物質(zhì)來(lái)合成多糖類(lèi)物質(zhì)、胞外酶類(lèi)、抗菌素和聚蘋(píng)果酸等（劉暢，2012;Rong et al.，2015;王建梓，2016）。由于芽短梗霉菌多糖類(lèi)物質(zhì)具有極佳的成膜性、可塑性及易自然降解，已廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、醫(yī)療、化妝品、水果保鮮等眾多領(lǐng)域（Choudhury et al.，2012;劉鑫，2015），是一種極具研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景的新型生物制品。但該菌株作為生防除草劑在雜草生防領(lǐng)域的研究在國(guó)內(nèi)外僅有少量報(bào)道，研究報(bào)道該菌可產(chǎn)生能抑制雜草和植物病害的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮防除作用（Prashanthi and Srikant，2005;Zhang et al.，2012;李永龍等，2014;宿翠翠，2016）。本研究旨在優(yōu)化源自植物的出芽短梗霉菌PA-2菌株的發(fā)酵條件，為該菌作為新型生物除草藥劑的研制提供理論參考。【前人研究進(jìn)展】在不同生境中發(fā)現(xiàn)的出芽短梗霉菌對(duì)生長(zhǎng)條件和環(huán)境要求各有不同，優(yōu)化適合特定菌株的發(fā)酵條件是研究利用該菌株的重要基礎(chǔ)（吳海霞等，2018）。不同學(xué)者采用單因素和正交優(yōu)化設(shè)計(jì)及Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)分別對(duì)出芽短梗霉菌的不同菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了發(fā)酵水平，縮短了發(fā)酵周期，為后續(xù)的工業(yè)生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。常帆等（2013）采用響應(yīng)面分析對(duì)出芽短梗霉As3.933產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)22.29 g/L，較初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基（17.32 g/L）提高28.70%。陳國(guó)強(qiáng)等（2017）采用單因子試驗(yàn)對(duì)出芽短梗霉菌A5菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳發(fā)酵條件下普魯蘭多糖的產(chǎn)量為22.9 g/L。陳曦等（2018）采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman法和正交試驗(yàn)對(duì)出芽短梗霉BK-10菌株的產(chǎn)聚蘋(píng)果酸條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下聚蘋(píng)果酸的糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)0.71 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)0.89 g/（L·h），較優(yōu)化前分別提高18.33%和71.15%。【本研究切入點(diǎn)】現(xiàn)階段對(duì)出芽短梗霉菌的研究以發(fā)酵產(chǎn)生糖類(lèi)物質(zhì)和提高發(fā)酵液活性物質(zhì)為主要方向，針對(duì)提高孢子數(shù)量的研究?jī)H有少量報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】出芽短梗霉菌PA-2菌株是青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）從自然感病的楊樹(shù)病葉上分離得到的一株對(duì)多種雜草具有較強(qiáng)防除作用，具有良好生防應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株（李永龍等，2014;程亮，2016）。本研究以PA-2菌株發(fā)酵液中產(chǎn)孢量為對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)，優(yōu)化PA-2菌株的培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件，以期為該菌作為除草劑的研發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 出芽短梗霉菌PA-2菌株由本實(shí)驗(yàn)室從自然感病楊樹(shù)葉上分離獲得并保存。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 菌株活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基;菌株種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L、酵母浸粉10.00 g/L、蛋白胨20.00 g/L。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌株活化和種子液制備 將實(shí)驗(yàn)室保存的出芽短梗霉菌PA-2菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣取菌塊（Φ=8 mm）接種于盛有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每50 mL接菌1塊，于25 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d作為種子液。

1. 2. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化

1. 2. 2. 1 固體培養(yǎng)基篩選 選擇7種不同的培養(yǎng)基（表1）進(jìn)行基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基篩選。取活化的菌種菌餅（Φ=8 mm）接種于不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中央，在25 ℃下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后5和14 d測(cè)量菌落直徑，觀察培養(yǎng)基中菌落直徑及形態(tài)特征。每處理重復(fù)3次。選擇菌落直徑較大的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1. 2. 2. 2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選 將種子發(fā)酵液以4%接種量分別接入裝有50 mL供試7種液體發(fā)酵培養(yǎng)基（表1）的錐形瓶中，于180 r/min、25 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)的第24、48、72、96、120、144和168 h分別測(cè)定產(chǎn)孢量，并繪制不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)曲線(xiàn)。每處理重復(fù)3次。選擇產(chǎn)孢量較大的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1. 2. 3 最適碳、氮源篩選 選擇4種碳源（玉米粉、小麥粉、蔗糖和葡萄糖）和5種氮源[KNO3、酵母膏、（NH4）2SO4、大豆粉和PDA]，分別等量代替篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源，配制成不同的碳、氮源培養(yǎng)基進(jìn)行PA-2菌株培養(yǎng)，根據(jù)發(fā)酵液中的產(chǎn)孢量篩選出最適碳、氮源種類(lèi)。每處理重復(fù)3次。

1. 2. 4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn) 對(duì)篩選出的培養(yǎng)基各成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將種子液以4%接種量接入裝有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，測(cè)定產(chǎn)孢量。每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)基各成分及水平選擇如表2所示。

1. 2. 5 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分及配比 以單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果為中心點(diǎn)，運(yùn)用Design Expert 8.0.6對(duì)主要因素碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽重新編碼，以PA-2菌株的產(chǎn)孢量為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素5水平響應(yīng)面（RSM）試驗(yàn)，其因素及水平（表3）根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD）原理進(jìn)行。

1. 2. 6 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn) 以?xún)?yōu)化的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測(cè)定不同初始pH（5、6、7、8和9）、發(fā)酵時(shí)間（0、12、24、36、48和60 h）、裝液量（20、40、60、80、100 和120 mL/250 mL）、接種量（4%、8%、10%、12%和16%）、培養(yǎng)溫度（15、20、25、30和35 ℃）和搖床轉(zhuǎn)速（140、160、180、200和220 r/min）對(duì)PA-2菌株產(chǎn)孢量的影響，每處理重復(fù)3次。

1. 2. 7 PA-2菌株可濕性粉劑對(duì)雜草藜的防除試驗(yàn)

按照篩選獲得的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行PA-2菌株發(fā)酵，發(fā)酵完成后噴霧干燥制成菌粉，加入不同助劑（硅藻土和聚乙烯醇等）制成孢子量為108個(gè)/g的可濕性粉劑。田間試驗(yàn)在青海省西寧市城北區(qū)二十里鋪鎮(zhèn)進(jìn)行，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積8 m2，按200 mL/m2噴藥液量進(jìn)行噴霧，可濕性粉劑設(shè)200、400、600和800 g/ha，以200 g/L氯氟吡氧乙酸EC為對(duì)照CK1、清水為對(duì)照CK2，每處理重復(fù)3次，在雜草藜7～8葉時(shí)進(jìn)行噴霧，施藥后7、20和40 d分別測(cè)定雜草藜的株高和鮮重，計(jì)算株高抑制率和鮮重防效。

株高抑制率（%）=（對(duì)照區(qū)株高-處理區(qū)株高）/對(duì)照區(qū)株高×100

鮮重防效（%）=（對(duì)照區(qū)鮮重-處理區(qū)鮮重）/對(duì)照區(qū)鮮重×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和DPS 6.50對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2. 1. 1 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 不同培養(yǎng)基上PA-2菌株的菌落形態(tài)及特征見(jiàn)表4。

由圖1可知，PA-2菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本相似，菌落顏色基本是從白色轉(zhuǎn)變?yōu)槟G色。在大多數(shù)培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為氣生菌絲生長(zhǎng)速度慢，基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度較快，且菌絲薄而稀疏。培養(yǎng)基Ⅵ和培養(yǎng)基Ⅶ菌絲發(fā)達(dá)，后期生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基Ⅵ菌落邊緣菌絲稀薄，氣生菌絲最發(fā)達(dá)致密，而培養(yǎng)基Ⅶ在培養(yǎng)后期與前期菌落表現(xiàn)一致。

由表5可知，培養(yǎng)第5 d時(shí)，PA-2菌株在培養(yǎng)基Ⅱ中生長(zhǎng)最好，菌落直徑達(dá)24.61 mm，顯著高于其他培養(yǎng)基處理（P<0.05，下同），在培養(yǎng)基Ⅵ上長(zhǎng)勢(shì)最差，菌落直徑僅為16.49 mm，顯著低于其他培養(yǎng)基處理;培養(yǎng)第14 d，PA-2菌株菌落直徑在PDA培養(yǎng)基、改良PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)基Ⅱ、培養(yǎng)基Ⅵ和培養(yǎng)基Ⅶ上無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。結(jié)合菌落形態(tài)觀察，選擇培養(yǎng)基Ⅶ為PA-2菌株的最適固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2. 1. 2 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 分別在不同發(fā)酵時(shí)間測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液中PA-2菌株的產(chǎn)孢量。由圖2可知，在相同發(fā)酵時(shí)間下均以培養(yǎng)基Ⅶ發(fā)酵液的產(chǎn)孢量最多，其中在培養(yǎng)96 h時(shí)的產(chǎn)孢量最大，達(dá)7.45×108個(gè)/mL;PDA培養(yǎng)基和改良PDA培養(yǎng)基發(fā)酵液中產(chǎn)孢量最低，幾乎不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢很少。因此，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)形態(tài)和生長(zhǎng)直徑，選取培養(yǎng)基Ⅶ為PA-2菌株產(chǎn)孢的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2. 2 培養(yǎng)基碳、氮源篩選結(jié)果

由表6可知，PA-2菌株在以葡萄糖和玉米粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，分別達(dá)5.10×105和2.93×105 個(gè)/mL，兩者孢子懸浮液的OD600間差異不顯著;在以大豆粉為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，達(dá)2.13×106個(gè)/mL，其孢子懸浮液的OD600顯著大于其他氮源處理。因此，選擇葡萄糖和大豆粉作為PA-2菌株產(chǎn)孢發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳、氮源。

2. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 3. 1 葡萄糖 由圖3可知，隨著葡萄糖添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈先緩慢增長(zhǎng)再下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖添加量為80.00 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為4.10×108個(gè)/mL;當(dāng)葡萄糖添加量增至100.00 g/L后產(chǎn)孢量呈下降趨勢(shì)。因此，選擇初始葡萄糖添加量80.00 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2. 3. 2 大豆粉 由圖4可知，隨著大豆粉添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈先增長(zhǎng)后下降的變化趨勢(shì)，在大豆粉添加量為35.00 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為4.20×108 個(gè)/mL，當(dāng)大豆粉添加量超過(guò)35.00 g/L后產(chǎn)孢量呈下降趨勢(shì)。因此，選擇初始大豆粉添加量35.00 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2. 3. 3 K2HPO4 由圖5可知，隨著K2HPO4添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈先增長(zhǎng)后下降的變化趨勢(shì)，在K2HPO4添加量為10.00 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為5.40×108 個(gè)/mL;當(dāng)K2HPO4添加量超過(guò)10.00 g/L后產(chǎn)孢量呈下降趨勢(shì)。因此，選擇K2HPO4添加量10.00 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2. 3. 4 MgSO4 由圖6可知，隨著MgSO4添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈緩慢增長(zhǎng)再下降的變化趨勢(shì)，在MgSO4添加量為0.80 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.50×108 個(gè)/mL;當(dāng)MgSO4添加量超過(guò)0.80 g/L后產(chǎn)孢量呈快速下降趨勢(shì)并且趨于平穩(wěn)。因此，選擇MgSO4添加量0.80 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2. 3. 5 NaCl 由圖7可知，隨著NaCl添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈先增長(zhǎng)后下降的變化趨勢(shì)，在NaCl添加量為4.00 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.60×108 個(gè)/mL;當(dāng)NaCl添加量超過(guò)4.00 g/L后產(chǎn)孢量呈顯著下降趨勢(shì)。因此，選擇NaCl添加量4.00 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2. 3. 6 （NH4）2SO4 由圖8可知，隨著（NH4）2SO4添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈緩慢增長(zhǎng)再快速下降趨勢(shì)，在（NH4）2SO4添加量為0.60 g/L時(shí)曲線(xiàn)輕微上升，在添加量為0.80～0.90 g/L時(shí)曲線(xiàn)幾乎達(dá)到平穩(wěn)，此時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值;當(dāng)（NH4）2SO4添加量超過(guò)0.9 g/L時(shí)產(chǎn)孢量呈顯著下降趨勢(shì)。因此，為了節(jié)約成本，選擇（NH4）2SO4添加量0.80 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2. 3. 7 KCl 由圖9可知，隨著KCl添加量的增加，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈先增長(zhǎng)再下降的趨勢(shì)，但增長(zhǎng)過(guò)程緩慢，在KCl添加量為1.20 g/L時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.60×108 個(gè)/mL;當(dāng)KCl添加量超過(guò)1.20 g/L后產(chǎn)孢量呈明顯下降趨勢(shì)。因此，選擇KCl添加量1.20 g/L為PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2. 4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6的CCD設(shè)計(jì)原理，對(duì)出芽短梗霉菌PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。

以出芽短梗霉菌PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基孢子數(shù)（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)CCD設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6對(duì)表7數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到孢子數(shù)與葡萄糖（A）、大豆粉（B）、無(wú)機(jī)鹽（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=10.09-0.8256A+1.04B-0.3081C+0.3213AB-1.72AC-2.27BC-1.75A2-1.47B2-0.2757C2

對(duì)回歸模型進(jìn)行可信度分析和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，模型F=23.15，P<0.0001，說(shuō)明該回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型模擬性較好。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9542，調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9130，預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.7707，說(shuō)明調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)（0.9130）與預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)（0.7707）有較合理的相符度，該模型具有較好的回歸性。模型信噪比>4，表明該模型具有足夠的信號(hào)響應(yīng)設(shè)計(jì)。因此，該模型能對(duì)出芽短梗霉菌PA-2菌株孢子量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程繪制試驗(yàn)因素間交互效應(yīng)三維立體響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)圖，觀察在一個(gè)因素不變的情況下其他兩個(gè)因素對(duì)產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10～圖12。其中，葡萄糖濃度與大豆粉濃度交互作用響應(yīng)面為開(kāi)口向下的凸形曲面，說(shuō)明葡萄糖濃度與大豆粉濃度的交互作用較顯著。在回歸方程求解得到出芽短梗霉菌PA-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的培養(yǎng)基條件為： 葡萄糖84.60 g/L，大豆粉46.35 g/L，無(wú)機(jī)鹽10.91 g/L[NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、（NH4）2SO4 0.52 g/L]，預(yù)測(cè)PA-2菌株產(chǎn)孢量最高值為12.76×108個(gè)/mL。

根據(jù)模型求出的最優(yōu)條件配制培養(yǎng)基，對(duì)模型進(jìn)行3次以上驗(yàn)證試驗(yàn)，得知出芽短梗霉菌PA-2菌株平均產(chǎn)孢量達(dá)10.68×108個(gè)/mL，與預(yù)測(cè)值相比無(wú)明顯差異，但略有不同。分析其原因可能是由于培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中含氧量、轉(zhuǎn)速、pH會(huì)隨著孢子數(shù)的上升而有所改變，從而導(dǎo)致最終實(shí)際產(chǎn)孢量與預(yù)測(cè)值略有不同。

2. 5 發(fā)酵條件優(yōu)化測(cè)定結(jié)果

2. 5. 1 初始pH 測(cè)定5個(gè)pH（5、6、7、8和9）對(duì)PA-2菌株產(chǎn)孢的影響，結(jié)果（圖13）表明，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 5～7時(shí)產(chǎn)孢量均隨著pH的增大而增加，pH為7時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.57×108 個(gè)/mL，顯著高于其他初始pH處理，當(dāng)pH大于7后PA-2菌株的產(chǎn)孢量明顯下降。說(shuō)明中性條件適合PA-2菌株生長(zhǎng)，因此，選擇pH 7為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)孢發(fā)酵的最佳pH。

2. 5. 2 發(fā)酵時(shí)間 發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h對(duì)PA-2菌株的產(chǎn)孢量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖14）表明，在發(fā)酵0～120 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，孢子數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，在發(fā)酵120 h時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.58×108個(gè)/mL，顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間處理;發(fā)酵120～192 h時(shí)產(chǎn)孢量趨于穩(wěn)定即進(jìn)入平臺(tái)期。因此，選擇120 h為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)孢發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2. 5. 3 接種量 由圖15可知，接種量在4%～8%時(shí)PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈明顯上升趨勢(shì)，接種量為8%時(shí)達(dá)最大值，為3.04×108 個(gè)/mL，顯著高于其他接種量處理;接種量超過(guò)8%后，PA-2菌株的產(chǎn)孢量明顯下降。因此，選擇8%作為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)孢發(fā)酵的最佳接種量。

2. 5. 4 搖床轉(zhuǎn)速 由圖16可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120～180 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速增大，PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈上升趨勢(shì)，在180 r/min時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.02×108 個(gè)/mL，顯著高于其他搖床轉(zhuǎn)速處理;當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)180 r/min后產(chǎn)孢量緩慢下降。因此，選擇180 r/min作為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)孢發(fā)酵最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2. 5. 5 發(fā)酵溫度 分別在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果（圖17）表明，在15～25 ℃時(shí)PA-2菌株的產(chǎn)孢量呈上升趨勢(shì)，25 ℃時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.05×108 個(gè)/mL，顯著高于其他發(fā)酵溫度處理;超過(guò)25 ℃后產(chǎn)孢量明顯下降。因此，選擇25 ℃作為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)孢發(fā)酵的最佳溫度。

2. 5. 6 裝液量 對(duì)發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基裝液量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖18）表明，在250 mL三角瓶中，裝液量為40～60 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，產(chǎn)孢量呈上升趨勢(shì)，裝液量在60 mL時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最大值，為3.43×108 個(gè)/mL，顯著高于其他裝液量處理;裝液量大于60 mL后產(chǎn)孢量明顯下降。因此，選擇60 mL為PA-2菌株搖瓶產(chǎn)芽孢發(fā)酵的最佳裝液量。

2. 6 PA-2可濕性粉劑對(duì)雜草藜的田間防除效果

由表9可知，PA-2可濕性粉劑對(duì)藜有明顯的防除作用，用藥量為800 g/ha時(shí)對(duì)藜的株高抑制率為55.7%、鮮重防效為75.0%，顯著高于用藥量為200和400 g/ha的防除效果，與對(duì)照藥劑200 g/L氯氟吡氧乙酸EC處理組（CK1）的株高抑制效果相當(dāng)，而鮮重防效顯著高于對(duì)照藥劑處理處理。因此，田間可使用PA-2可濕性粉劑防除雜草藜。

3 討論

孢子是微生物產(chǎn)生的繁殖體，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要中間體，孢子的質(zhì)量、數(shù)量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量和生物活性均有明顯影響，其受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境等因素的綜合影響（許麗娟等，2008）。孢子產(chǎn)率是決定生防菌制劑的重要指標(biāo)（李鴻文和馮明光，2008）。通過(guò)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化以提高孢子產(chǎn)量，可為工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用生防菌劑提供保障。本研究結(jié)果表明，出芽短梗霉菌PA-2菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅶ上菌落直徑和產(chǎn)孢量最高，與常帆等（2013）對(duì)出芽短梗霉菌A5的研究結(jié)果略有差異，可能是針對(duì)最后的代謝產(chǎn)物應(yīng)用方向不同所致;葡萄糖作為碳源對(duì)出芽短梗霉菌PA-2菌株的產(chǎn)孢有利，與宋小娜（2014）對(duì)該菌的研究結(jié)果一致，且葡萄糖價(jià)格便宜、成本低，適合工業(yè)大批量發(fā)酵。大豆粉作為氮源的培養(yǎng)基有利于PA-2菌株產(chǎn)孢和生長(zhǎng)，與張文芝等（2010）對(duì)蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156的研究結(jié)果一致，而添加其他氮源[（NH4）2SO4和KNO3]不利于孢子形成，說(shuō)明無(wú)機(jī)氮源不利于孢子的形成，與吳海霞等（2018）報(bào)道的酵母膏對(duì)海洋細(xì)菌GM-1-1的孢子形成不利相吻合。

本研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，得到PA-2菌株產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖84.60 g/L，大豆粉46.35 g/L，無(wú)機(jī)鹽10.91 g/L[NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、（NH4）2SO4 0.52 g/L]，優(yōu)化后PA-2菌株的產(chǎn)孢量為10.68×108 個(gè)/mL，提高了產(chǎn)孢量，表明該菌株在生產(chǎn)上具有較好的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步的除草研究及后期生防制劑工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要數(shù)據(jù)。

在發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PA-2菌株對(duì)外界pH環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，中心偏酸的環(huán)境更適于PA-2菌株產(chǎn)孢，也解釋了酵母菌多存在于酸性環(huán)境下的觀點(diǎn)（Lima et al.，2003）。在培養(yǎng)溫度的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PA-2菌株在25 ℃下產(chǎn)孢量最大，與李世杰等（2000）對(duì)短梗霉多糖的研究結(jié)果存在差異，可能與其長(zhǎng)期棲居的自然環(huán)境有關(guān)，或者與孢子和代謝產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的要求條件不一致有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間在120 h時(shí)PA-2菌株的產(chǎn)孢量最大，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨著時(shí)間的推移，菌體自溶導(dǎo)致孢子量下降。

本研究按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對(duì)PA-2菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，干燥后添加助劑制成PA-2可濕性粉劑，其對(duì)雜草藜的株高抑制率最高為55.7%、鮮重防效最高可達(dá)75.0%，與對(duì)照藥劑200 g/L氯氟吡氧乙酸EC處理組的株高抑制效果相當(dāng)，但鮮重防效顯著高于對(duì)照藥劑。為提高PA-2可濕性粉劑對(duì)雜草藜的防除效果，今后將開(kāi)展菌藥混配方面的試驗(yàn)研究，為田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

PA-2菌株產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖84.60 g/L、大豆粉46.35 g/L、NaCl 2.59 g/L、MgSO4 0.52 g/L、KCl 0.78 g/L、K2HPO4 6.50 g/L、（NH4）2SO4 0.52 g/L;最佳發(fā)酵條件為pH 7、溫度25 ℃、裝液量60 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量8%、培養(yǎng)時(shí)間120 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)和發(fā)酵條件可有效提高PA-2菌株的產(chǎn)孢量，降低發(fā)酵成本，適合發(fā)酵放大試驗(yàn)及相關(guān)劑型的開(kāi)發(fā)研究;可采用PA-2菌株生產(chǎn)菌劑應(yīng)用于雜草防除。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）