半番鴨不同組織Cu/Zn-SOD基因表達及酶活性研究

鄭嫩珠 章琳俐 李麗 辛清武 繆中緯 朱志明 黃一帆

摘?要：【目的】首次對半番鴨不同組織Cu/Zn-SOD基因表達、酶活性進行研究，以期了解半番鴨不同組織抗氧化特性，為深入研究半番鴨對環(huán)境因子的響應能力及相關(guān)分子機制提供參考。【方法】通過實時熒光定量法、黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分別測定了半番鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相對表達量、酶活力和MDA含量。【結(jié)果】 Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相對表達量最高，總體趨勢為胸肌>肝臟>肺>心臟>脾臟>腎臟/肌胃。酶活力測定結(jié)果顯示，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD酶活力顯著高于胸肌和肌胃。半番鴨胸肌MDA含量顯著高于肝臟、肌胃和腎臟，提示胸肌可能更易受到氧化應激損傷。相關(guān)分析結(jié)果顯示Cu/Zn-SOD活力與MDA含量呈顯著負相關(guān)，而抗氧化酶活力與mRNA表達水平相關(guān)性不顯著。【結(jié)論】半番鴨Cu/Zn-SOD基因表達和酶活力具有組織特異性。不同組織Cu/Zn-SOD活力差異可能與Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及組織代謝水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Cu/Zn-SOD; mRNA表達; 酶活力; 半番鴨

中圖分類號：X 131;X 53文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-933-06

Abstract：【Objective】 Expressions of Cu/Zn-SOD gene and activities of the antioxidant enzyme in various organs of mule ducks were determined. 【Method】 The gene expression?in the heart， liver， spleen， lung， kidney， gizzard and chest muscles，antioxidant enzyme activities，and MDA contents of mule duck were determined by the qRT-PCR， xanthine-xanthine oxidase， and thiobarbituric acid methods. 【Result】 The greatest mRNA expression of Cu/Zn-SOD gene was found in the chest muscle followed by the tissues in the order of liver>lung> heart>spleen>gizzard/kidney of the ducks. The activities of Cu/Zn-SOD enzyme in the liver and kidney were significantly higher than those in the breasts and gizzard. The higher MDA content in the breasts than in the liver， gizzard or kidney indicated a greater susceptibility of the chest muscle to damage by oxidative stress. There was no significant correlation observed between the antioxidant enzyme activity and the mRNA expression level in different organs. However， the Cu/Zn-SOD enzyme activity was inversely correlated to MDA content in the tissues. 【Conclusion】 The Cu/Zn-SOD mRNA expression and enzyme activity were organ-specific. The differences in the enzymatic activities might stem from the diverse physiological functions of the enzymes and/or the tissue metabolism per se.

Key words：Cu/Zn-SOD; mRNA expression; enzyme activity; mule duck

0?引言

【研究意義】動物機體有氧代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基和其他活性氧。正常生理條件下，機體能通過抗氧化系統(tǒng)清除自由基。抗氧化系統(tǒng)失衡或異常將導致自由基過度累積，引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、酶失活等氧化損傷[1]。畜禽生產(chǎn)中抗氧化系統(tǒng)失衡可表現(xiàn)為畜禽對運輸或運動過程的應激易感，使宰后組織氧化損傷、肉質(zhì)下降，甚至病理損傷[2]。越來越多的證據(jù)顯示，家禽生產(chǎn)中的許多應激都與氧化應激有關(guān)[3]。禽類疾病如雞腎病、肉雞腹水綜合征、鴨病毒性肝炎發(fā)生過程中由于自由基清除系統(tǒng)失代償或衰竭使細胞內(nèi)累積過量自由基，導致細胞膜損傷和細胞成分的改變，引起病理性損傷[4-6]。了解組織抗氧化特性及相關(guān)基因表達的分子機制，對于研究如何減少家禽生產(chǎn)中各種應激的負面影響具有重要意義。【前人研究進展】抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)重要組成成員之一，是清除自由基和活性氧的第一道防線，其中超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化酶類中的重要成員[7]，可快速歧化活性氧（·O-2），使其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和分子氧，從而特異性清除活性氧（·O-2） ?[8-9]。丙二醛（MDA）是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而形成，其含量可反映自由基的產(chǎn)生情況和器官組織中脂質(zhì)過氧化的程度[10]。研究報道顯示不同物種和組織間SOD的活性和基因表達水平不同 [11-12]。Surai等[13]報道雞胚胎時期不同組織SOD活性變化趨勢不同，新生雛雞不同組織間酶活性也存在差異。【本研究切入點】目前對于動物抗氧化酶的研究多集中于哺乳動物以及禽類中的雞，關(guān)于鴨抗氧化酶的研究較少。半番鴨是繼北京鴨、番鴨后極具發(fā)展?jié)摿Φ娜庥螟啠撬萑庥闷贩N改良研究的熱點之一，具有瘦肉率高、脂肪少、耐粗飼、抗病力強等特點，也是生產(chǎn)肥肝和羽毛的重要來源[14]。半番鴨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度雖然很快，但闡述其各性狀發(fā)展的資料還很少 [15-16]，針對抗氧化酶在半番鴨各組織器官的分布和活性的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究通過測定半番鴨不同組織抗氧化酶基因表達、酶活力及丙二醛含量，探索半番鴨不同組織抗氧化特性，從而為半番鴨對環(huán)境因子（如應激）響應能力的研究提供理論參考，在科研和生產(chǎn)上都具有一定生物學意義。

1?材料與方法

1.1?試驗動物與樣品采集

試驗鴨飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物養(yǎng)殖試驗場。鴨飼養(yǎng)管理條件一致，自由采食，自由飲水，按常規(guī)操作程序?qū)υ囼烒嗊M行管理。飼料由福建華龍集團飼料有限公司提供，不同生長時期的飼料營養(yǎng)水平見表1。70日齡時，隨機選取5只同批次健康的半番鴨（體重約3 kg），頸動脈放血處死后，采集其組織樣品（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃和胸肌），立即投入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取組織總RNA，超微量紫外分光光度計（Thermo Scientific， 美國）檢測RNA含量、純度及質(zhì)量，并調(diào)整總RNA濃度至1 μg·μL-1;利用Super ScriptTM III First-Strand Synthesis Super反轉(zhuǎn)試劑盒（Invitrogen， 美國）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?抗氧化酶基因的表達分析

根據(jù)GenBank已公布的鴨Cu/Zn-SOD（SOD1）和β-actin基因序列，應用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設(shè)計引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。以β-actin基因為內(nèi)參，CFX384多重實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad， 美國）檢測半番鴨各組織Cu/Zn-SOD mRNA表達情況，每個樣品重復3次。反應體系（20 μL）： Power SYBR?Green Master Mix 10 μL（Applied Biosystems，美國）、SDW 8.0 μL、1 μg·μL-1 cDNA 1.0 μL、10 μmol·L-1 PCR-F 0.5 μL、10 μmol·L-1 PCR-R 0.5 μL和ddH2O 10.5 μL。反應條件：95℃ 1 min，95℃15 s，63℃ 25 s，40個循環(huán);熔解曲線分析 55～95℃。通過熔解曲線判斷定量PCR的特異性。采用2-ΔΔCt值方法計算mRNA相對表達量。

1.4?抗氧化酶活力及MDA含量測定

超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和丙二醛（MDA）測定試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。樣品用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清，測定蛋白濃度后，應用相應試劑盒和ELX800通用酶標儀（BIO-TEK Instruments Inc， 美國）測定Cu/Zn-SOD活力和MDA含量，操作步驟按照試劑說明書進行。Cu/Zn-SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法（Thibabituric Acid， TBA）測定。

1.5?數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0軟件對不同組織Cu/Zn-SOD mRNA相對表達量、酶活力和MDA含量進行描述性數(shù)據(jù)、多重比較、顯著性檢驗及相關(guān)性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?半番鴨Cu/Zn-SOD基因的qRT-PCR檢測

由圖1可知，β-actin和目的基因的擴增曲線均呈 “S” 形，基線平緩并且未呈現(xiàn)明顯的上揚趨勢，表明各基因的動力學曲線整體平行性較好。各基因熔解曲線存在一個明顯的單峰，表明擴增產(chǎn)物單一，熒光強度均來自特異性擴增產(chǎn)物，未見有引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物產(chǎn)生。

2.2?Cu/Zn-SOD基因組織表達特點

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖2），Cu/Zn-SOD mRNA在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和胸肌5種組織中有表達，腎臟和肌胃無表達或者表達量極低，不同組織間表達差異明顯。其中胸肌表達量最高，其他組織間差異達到極顯著水平（P<0.01）， 總體趨勢： 胸肌>肝臟>肺臟>心臟>脾臟>腎臟/肌胃。

2.3?半番鴨組織Cu/Zn-SOD活力與MDA含量

選取肝臟、胸肌、腎臟、肌胃，檢測Cu/Zn-SOD活力和MDA含量。由表3可知，不同組織間Cu/Zn-SOD酶活力明顯不同，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD酶活力顯著高于胸肌和肌胃（P<0.01），肝臟的Cu/Zn-SOD酶活力約為胸肌的4.5倍;胸肌和肌胃間差異不顯著。總體情況為：肝臟>腎臟>肌胃>胸肌。MDA含量在胸肌中最高，肝臟、肌胃次之，腎臟最低。MDA含量胸肌極顯著高于其他組織（P<0.01），肝臟MDA含量與肌胃間差異不顯著，腎臟含量最低。2.4?Cu/Zn-SOD活力與mRNA表達量、MDA含量的相關(guān)性分析

利用SPSS17.0軟件對各組織抗氧化酶活力與mRNA表達、MDA含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在半番鴨4個組織中，抗氧化酶活力與mRNA表達水平無顯著相關(guān);Cu/Zn-SOD活力與MDA含量呈顯著負相關(guān)（P<0.05）（圖3）。

3?討?論

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的抗氧化酶，在機體抗氧化系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用。大量研究表明，自由基、活性氧增加或抗氧化物能力下降與基因表達的改變密切相關(guān)[17-18]。Cu/Zn-SOD是SOD家族中第一個被發(fā)現(xiàn)也是分布最廣泛的一種，活性中心包含銅離子和鋅離子，其基因序列和結(jié)構(gòu)從原核生物到真核生物高度保守，但基因表達在不同物種和組織間不同。本研究中半番鴨Cu/Zn-SOD mRNA在多數(shù)器官表達，在胸肌中表達最高，這與Xu等[19]在豬上的報道相似;另有報道哺乳動物Cu/Zn-SOD mRNA在肝臟和腎臟高表達，如豚鼠Cu/Zn-SOD mRNA表達由強至弱順序為： 肝>腎>肺 >脾>心[20-21]。

半番鴨不同組織的酶活力呈現(xiàn)出一定差異，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD活力高于胸肌和肌胃，這與朱子玉等[22]在絲毛烏骨雞和北京油雞上的報道類似;Marklund[23] 對豬、牛、羊等動物研究也顯示肝臟和腎臟等代謝活躍的器官Cu/Zn-SOD活力較高，其他組織具有相似的中等酶活力。不同組織酶活力的差異可能與Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及組織代謝水平有關(guān)。肝臟是動物物質(zhì)、能量代謝的重要器官，也是體內(nèi)重要的解毒器官，對動物生長起著重要作用，可產(chǎn)生大量活性氧自由基，需要較強的抗氧化能力加以清除，防止過量活性氧自由基損害肝臟。腎臟是禽類重要排泄器官，也具有較高的生理代謝水平。本研究中半番鴨Cu/Zn-SOD活力與mRNA表達水平并不完全一致，并且兩者相關(guān)性不顯著，可能由于抗氧化酶基因表達可受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響[24]，而抗氧化酶活力會受底物水平、營養(yǎng)等因素影響，因此抗氧化酶mRNA表達水平和其活力未呈現(xiàn)簡單的相關(guān)性[19-20]。

半番鴨MDA含量與SOD 活力之間存在顯著負相關(guān)，與Zhang等[25]在雞上的報道類似，SOD活力的減少伴隨MDA含量增加。半番鴨胸肌MDA含量顯著高于肝臟、肌胃和腎臟，提示胸肌可能更易受到氧化應激損傷。在養(yǎng)殖和運輸過程中應更注意減少應激，降低其對肉品質(zhì)的影響。

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（責任編輯：張?梅）