基于效液相色譜法測定參附注射液中人參皂苷的濃度

羅宇文 楊亦炳 王文娟

摘要 目的：評價高效液相色譜法（HPLC）指紋圖檢測方法測試參附注射液中人參皂苷的濃度。方法：采用Agilengt-1100高效液相色譜儀進行試驗研究，色譜柱選用Agilent的ZORBAX SB-C18柱，具體參數為5 μm×250 mm×4.6 mm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，選擇流動相的條件是在A流動相水和B流動相乙腈中以1 mL/min的流速進行HPLC研究。分別對HPLC方法學的嚴謹性進行檢測，包括專屬性試驗、精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗、線性回歸試驗、加樣回收率試驗等逐步建立方法的科學性;而后進一步采用HPLC對參附注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的濃度進行具體的檢測和統計分析。結果：專屬性結果顯示4種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均具有良好的分離度，拖尾因子均在0.98～1.04范圍。線性回歸方程：人參皂苷Rg1為Y=11 278X-54.71，人參皂苷Re為Y=3 633X-36.34，人參皂苷Rb1為Y=8 640X-4.18，人參皂苷Rd為Y=7 088X+35.03，所有人參皂苷相關系數均>0.999，結果顯示人參皂苷線性關系良好。人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd峰面積的RSD分別為1.23%、1.28%、1.33%、1.20%、1.35%，結果表明HPLC具有良好的精密度。人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面積RSD分別為0.44%、0.75%、0.25%、0.85%;結果表明參附注射液供試品溶液在24 h內穩定。人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分別為1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%，結果顯示HPLC具有良好的重復性。加樣回收率，人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分別為1.82%、1.04%、1.54%、2.07%，結果顯示加樣回收率均良好。不同批次參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的濃度存在較大差別。結論：高效液相色譜法檢測不同批次參附注射液中人參皂苷的濃度存在較大差異。

關鍵詞 高效液相色譜法;參附注射;線性回歸方程;加樣回收率;人參皂苷Rg1;人參皂苷Re;人參皂苷Rb1;人參皂苷Rd

Abstract Objective：To test the concentration of ginsenoside in Shenfu Injection by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：The Agilengt-1100 HLPC was used in this study.ZORBAX SB-C18 column of the Agilent was selected as the chromatographic column，whose specific parameter was 5 μm × 250 mm × 4.6 mm，the column temperature was 30 ℃ and the sample volume was 10 μL.The condition of selecting the mobile phase was to study at the 1 mL/min velocity in the A flow phase water and the B flow phase acetonitrile.The rigor of the HPLC methodology was tested respectively.The scientificity of the method was gradually established by steps such as specificity test，precision test，stability test，repeatability test，linear regression test，sample recovery test and so on.Then the HPLC was used to perform specific detection and statistical analysis of the concentrations of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1 and ginsenoside Rd in the Shenfu Injection.Results： 1）The specificity outcome showed that the separation degrees of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1 and ginsenoside Rd were good.Their tailing factors were within the range of 0.98-1.04.The results showed that the HPLC method in the study of detecting the concentration of ginsenoside in the Shenfu Injection was of good specificity. 2）Linear regression equation：ginsenoside Rg1′s was Y=11 278X-54.71; ginsenoside Re′s was Y=3 633X-36.34; ginsenoside Rb1′s was Y=8 640X-4.18; and ginsenoside Rd′s was Y=7 088X+35.03.All the correlation coefficients of the ginsenosides were higher than 0.999，and the results showed that the linear relationship of the ginsenoside was good. 3）The RSD of peak area of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.23%，1.28%，1.33%，1.20% and 1.35% respectively.The results showed that the HPLC instrument had good precision.The RSD of peak area of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 0.44%，0.75%，0.25% and 0.85% respectively.The test results showed that the sample solution of Shenfu Injection was stable within 24 hours.The RSD of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.18%，1.47%，1.86%，1.59% and 1.30% respectively.The results showed that the HPLC method had good repeatability. 4）The HPLC was used for determining the sample recovery rate，and the results showed that the RSD of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.82%，1.04%，1.54% and 2.07% respectively，which showed that the sample recovery rate was good. 5）The concentrations of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd in different batches of Shenfu Injection were quite different.Conclusion：The concentration of ginsenoside determined by HPLC in Shenfu Injection of different batches is quite different.

Key Words High performance liquid phase; Shenfu Injection; Linear regression equation; Sample recovery rate; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Re; Ginsenoside Rb1; Ginsenoside Rd

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.012

參附注射液源于古方“參附湯”，原方由紅參、附子兩味中藥組成為一種常用的急救藥物，在中醫藥理論指導下主治元氣大虧，陽氣暴脫等急癥。隨著中藥制劑的改革，參附注射液隨之問世并廣泛運用于臨床，目前臨床多用于心力衰竭類型的疾病[1-3]，用于增強心臟收縮功能和抗心力衰竭。有研究顯示，參附注射液中的有效成分之一是人參皂苷，人參皂苷按皂苷元的不同類型可分為兩類，即原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷，其中根據含量的高低原人參二醇型皂苷的亞型Rb1、Rd等[4-5]，原人參三醇型皂苷的亞型根據含量高低排序依次為Re、Rg1等。而近年來，人參皂苷顯著的藥理活性越來越被人們所熟知，研究報道顯示，人參皂苷Rh2、Rg3和Rk1均具有抗腫瘤的藥理活性[6-9]，人參皂苷Rg3具有神經保護作用，改善腦缺血損傷，人參皂苷Rg3、Rg5和Rk1具有羥自由基清除能力和抗炎等藥理作用。本研究為完善參附注射液的質量控制體系，基于高效液相色譜法（HPLC）測定參附注射液中人參皂苷濃度，具體選取原人參二醇型中皂苷含量較高的人參皂苷Rb1、Rd和原人參三醇型皂苷種含量較高的人參皂苷Rg1、Re等共4種人參皂苷成分進行分析研究。現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀（產品型號：1260），色譜柱采用同色譜儀同廠家的匹配型號ZORBAX SB-C18柱，色譜儀產品配件：四元梯度泵，單元是DAD多波長檢測器，Agilent系列產品均購于美國Agilent Techologies公司;精密BS210S型電子天平購于德國Sartorius公司。

1.2 試劑 對照品人參皂苷Rb1對照品（產品批號：110704-20092）、人參皂苷Rd對照品（產品批號：111818-201302）、人參皂苷Rg1對照品（產品批號：110703-201027）、人參皂苷Re對照品（產品批號：110754-200822）均購于中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈，去離子水和分析純均購買于湖北杜克化學科技有限公司。

1.3 分析樣品 3個不同批次的參附注射液（國藥準字Z51020664）購于華潤三九（雅安）藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilengt-1100高效液相色譜儀進行試驗研究，色譜柱選用Agilent的ZORBAX SB-C18柱，具體參數為5 μm×250 mm×4.6 mm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，以水和乙腈（以下分別稱之為流動相A和流動相B）作為本次研究的流動相的條件，并以1 mL/min的流速開展參附注射液的HPLC人參皂苷濃度研究，根據高效液相色譜法（HPLC）的梯度洗脫程序進行試驗。見表1。在這個色譜條件下獲得參附注射液樣品HPLC圖譜（圖1）和混合對照品HPLC圖譜（圖2）。

2.2 對照品溶液的制備

所有人參皂苷均由中國食品藥品檢定研究院檢測合格后提供，在對照品溶液的制備中，首先將中國食品藥品檢定研究院提供的4種人參皂苷對照品（即人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rd對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品）進行精密稱取，分別放于對應名稱的含有甲醇容量瓶中，待各種人參皂苷對照品充分溶解后，再取一個干燥的容量瓶對4種人參皂苷對照品進行混合，由此獲得混合人參皂苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別從3個不同生產批次的參附注射液中取出適量待測樣品，將其編號為001、002、003，再將待測樣品置于0.22 μm的微孔濾膜進行過濾，最終獲得參附注射液供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”項色譜條件進行HPLC檢測，結果顯示4種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均具有良好的分離度，拖尾因子均在0.98～1.04范圍內，說明本實驗采用HPLC檢測參附注射液中人參皂苷濃度的研究具有良好的專屬性。

2.5線性關系考察：4種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均取適量，并根據由低到高的濃度梯度，每種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均制備5種不同的質量濃度，其中人參皂苷Rg1的質量濃度為31.72、63.44、95.16、126.88、158.60 μg/mL;人參皂苷Re的質量濃度為11.43、22.86、34.29、45.72、57.15 μg/mL;人參皂苷Rb1的質量濃度為129.87、259.74、389.61、519.48、649.35 μg/mL;人參皂苷Rd的質量濃度為18.71、37.42、56.13、74.84、93.55 μg/mL;隨后將4種人參皂苷根據從低到高的濃度分別混合獲得5種質量濃度的人參皂苷混合對照品溶液，分別編號1-5并連續進樣，進樣量10 μL，以峰面積為縱坐標Y軸，對照品質量濃度為橫坐標X軸，繪制標準曲線進行線性回歸，計算各個人參皂苷的回歸方程、相關系數。結果詳見表2。提示人參皂苷的線性關系良好。

2.6 精密度試驗

精密度試驗采用的是人參皂苷混合對照品溶液，每次進樣均取10 μL，連續進樣6次，根據色譜條件檢測并記錄所有色譜峰的峰面積，計算RSD值，本研究結果顯示4種人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd根據峰面積計算的RSD分別為1.23%、1.28%、1.33%、1.20%、1.35%，結果表明HPLC儀器具有良好的精密度。

2.7 供試品溶液穩定性試驗

為了檢測參附注射液樣品在24 h內的穩定性，將其室溫放置，準備7份容器并標明時間點，分別為0、1、2、3、6、12、24 h，根據時間的先后順序進行HPLC檢測，記錄參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面積，本研究結果顯示：人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面積RSD分別為0.44%、0.75%、0.25%、0.85%;本研究結果表明，參附注射液供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性試驗

重復性試驗的檢測樣品是參附注射液供試品溶液，需要嚴格取同一個批次的參附注射液，分成6份進行HPCL檢測，計算各物質的質量濃度，人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的平均質量濃度分別為51.73、22.33、156.85、140.36 μg/mL，人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分別為1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%，結果顯示HPLC和參附注射液均具有良好的重復性。

2.9 加樣回收率試驗

加樣回收試驗需要同時精密量取0.12、0.20、0.28 mL的混合對照品溶液和參附注射液供試品溶液，通過HPLC檢測已知濃度樣品和對照品進行比較并計算平均回收率，結果顯示人參皂苷的加樣回收率良好，具有較好的準確度。具體見表3。

2.10 樣品測定結果

不同批次參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的濃度存在較大差別。見表4。

3 討論

參附注射液作為急救藥物，在臨床中的應用越來越廣泛，它主要針對陽氣暴脫癥和陽虛所致的驚悸、怔忡等急性病癥。目前關于參附注射液的藥理研究眾多，如抗心力衰竭[10]、保護缺血再灌注損傷[11]和抗休克[12]等，但至今為止對參附注射液有關其化學成分、成分濃度分析等的研究鮮見報道。近年來中藥注射劑的不良反應報道屢見不鮮[13]，目前有很多的因素影響著中藥注射劑的安全性和有效性，除了討論最多的制備工藝這一影響因素外，還有中藥注射劑質量的評估標準，再到具體發揮藥效的物質等各種影響環節[14]。因此為保證參附注射劑的臨床療效，不應拘泥于單一成分、單一指標，而應著眼于多成分多指標，對藥物產品進行全方位的質量評價，以確保參附注射液的藥效物質基礎，也為保證參附注射液的用藥安全提供科學依據。我們主要研究參附注射液中的人參皂苷這以藥效物質，關于人參皂苷的分離、純化的研究早在20世紀60年代就有文獻[15-16]報道，詳細闡述了人參皂苷的水解過程以及水解后得到的產物化學結構。研究人員在前人的基礎上，進一步提取人參中的人參皂苷，采用薄層層析分析并命名獲得的人參皂苷各個亞型，命名原則根據薄層層析所得Rf值大小命名子成分。而本研究選擇了4種含量較高的人參皂苷成分進行分析研究，這4種人參皂苷的Rf值由小到大的順序依次為Rb1、Rd、Re、Rg1[17-18];其中人參皂苷Rb1、Rd屬于原人參二醇型，而人參皂苷Rg1、Re屬于原人參三醇型皂苷[19]。

在參附注射液中人參皂苷的Rg1、Re、Rb1和Rd等4種亞型濃度的檢測工作中發現，采用可見紫外分光分光度法僅對總人參皂苷濃度的檢測敏感度較高，而對Rg1、Re、Rb1和Rd等4種亞型的敏感性較低，因此未采取該法測定參附注射液中的人參皂苷濃度;而薄層掃描法（TLCS）操作步驟相對較復雜，實驗過程中對外界條件要求較高，反而一定程度影響Rg1、Re、Rb1和Rd等4種亞型的敏感性;而在HPLC的操作過程中，方法簡便易行，系統較封閉，分離過程不易受外界影響，在方法嚴謹性考察中，專屬性、精密度、穩定性和重復性均良好，這充分顯示了HPLC檢測法的高效能、高敏度及高廣度的應用特點。鑒于此我們選用HPLC作為主要檢測手段，并結合線性回歸方程對參附注射液在某一個濃度或峰高（面積）條件的樣品成分進行測定，檢測其是否符合紫外檢測器的朗伯比爾定律。本研究結果顯示，線性回歸方程：人參皂苷Rg1為Y=11 278X-54.71，人參皂苷Re為Y=3 633X-36.34，人參皂苷Rb1為Y=8 640X-4.18，人參皂苷Rd為Y=7 088X+35.03，所有人參皂苷相關系數均>0.999，說明人參皂苷線性關系良好;而參附注射液的加樣回收試驗結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分別為1.82%、1.04%、1.54%、2.07%，說明人參皂苷的加樣回收率均良好，與其他參附注射液的相關HPLC研究的加樣回收率的結果一致[20]。本研究關于流動相的試驗性探索中，在Agilent ZORBAX SB-C18柱中，對比甲醇-水和乙腈-水這2種流動相的差異，本研究通過對比發現，當乙腈-水作為流動相時，HPLC用最少的分析時間得到的人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd分析圖中的峰形具有最高的分離度、最低的干擾度，其峰形的基線噪聲也是最低的。HPLC試驗過程中，經二極管陣列檢測器進行紫外光譜掃描，比較了202 nm波長和203 nm波長對人參皂苷皂苷濃度檢測的影響，結果表明4種人參皂苷均在202 nm處的最大吸收情況和雜質影響狀況均不如其在203 nm處，故本研究確定檢測波長為203 nm。

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（2018-11-22收稿 責任編輯：楊覺雄）