桂枝茯苓丸對子宮肌瘤模型大鼠的作用機制

陳智昌 潘春梅 郭虹

摘要 目的：評價桂枝茯苓丸對子宮肌瘤模型大鼠的療效，同時觀察其對子宮組織病理及PI3K-AKT信號通路的作用。方法：選取90只雌性SD大鼠并隨機分為空白組、模型組及中藥組，每組30只。模型組及中藥組大鼠進(jìn)行苯甲酸雌二醇注射液腹腔注射模擬子宮肌瘤模型，空白組大鼠接受等劑量生理鹽水腹腔注射，造模成功后中藥組大鼠進(jìn)行桂枝茯苓丸灌胃，空白組及模型組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃18 d。比較各組大鼠子宮濕重、子宮系數(shù)、子宮平滑肌層厚度變化，用Masson染色比對各組大鼠子宮組織病理的變化，用Western blotting檢測子宮組織PI3K、AKT、p-AKT水平的變化，免疫組織化學(xué)法檢測各組雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）的表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，模型組及中藥組的子宮濕重、子宮系數(shù)及子宮平滑肌層厚度明顯增加，中藥組上述指標(biāo)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Masson染色顯示空白對照組子宮組織切片著色為紅色，極少量染色纖維組織;模型組大鼠子宮環(huán)行肌和縱行肌可見大量的深藍(lán)色纖維組織，甚至部分肌層組出現(xiàn)明顯的團塊狀纖維結(jié)構(gòu);中藥組大鼠子宮組織的纖維化程度明顯受到抑制。與空白組比較，模型組及中藥組大鼠子宮組織的PI3K、p-AKT水平上調(diào)，T-AKT各組水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其中中藥組PI3K、p-AKT水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組及中藥組子宮平滑肌ER及PR陽性表達(dá)率升高，其中中藥組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：桂枝茯苓丸可明顯抑制子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展，其作用機制可能是通過PI3K-AKT信號通路介導(dǎo)孕激素/雌激素受體實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 子宮肌瘤模型;大鼠;桂枝茯苓丸;病理變化;PI3K-AKT;信號通路

Abstract Objective：To evaluate the effects of Guizhi Fuling Pills（GZFP）on uterine fibroids in rats，and to observe its effect on uterine histopathology and PI3K-AKT signaling pathway.Methods：A total of 90 female SD rats were randomly divided into a blank group，a model group and a Chinese medicine group，with 30 rats in each group.Rats in the model group and the Chinese medicine group were intraperitoneally injected with estradiol benzoate to simulate uterine leiomyoma model.Rats in blank group were injected intraperitoneally with the same dose of normal saline.Rats in the Chinese medicine group were given GZFP intragastric administration after successful modeling.Rats in the blank group and the model group were given the same dose of normal saline intragastric administration once a day，for continuous 18 d.The changes of uterine wet weight，uterine coefficient and thickness of uterine smooth muscle layer were compared in each group.The pathological changes of uterine tissues were compared by Masson staining.The concentrations of PI3K，AKT and p-AKT in uterine tissues were detected by Western blotting.The estrogen receptor（ER）and progesterone receptor（PR）were detected by immunohistochemistry.Results： 1）Compared with the blank group，the wet weight of uterus，the coefficient of uterus and the thickness of smooth muscle layer of uterus in the model group and the Chinese medicine group were significantly increased，and the above indexes in the Chinese medicine group were significantly lower than those in the model group.The difference was statistically significant（P<0.05）. 2）Masson staining showed that in the blank control group，uterus tissue slices were red and few.In the model group，a large number of dark blue fibrous tissue could be seen in the uterine circular and longitudinal muscles，and even some of the myometrial groups had obvious lumpy fibrous structure. 3）Compared with the blank group，the concentrations of PI3K and p-AKT in the uterus of the model group and the Chinese medicine group were up-regulated.There was no significant difference in the concentrations of T-AKT among the three groups（P>0.05）.The concentrations of PI3K and p-AKT in the Chinese medicine group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）. 4）Compared with the blank group，the positive expression rate of ER and PR in uterine smooth muscle of the model group and the Chinese medicine group increased，and the expression rate of ER and PR in the Chinese medicine group was lower than that in the model group.The difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：GZFP can significantly inhibit the occurrence and development of uterine leiomyoma，and its mechanism may be mediated by PI3K-AKT signaling pathway progesterone/estrogen receptor.

Key Words Uterine fibroids model; Rats; Guizhi Fuling Pills; Pathological changes; PI3K-AKT; Signaling pathway

中圖分類號：R289.5;R711文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.018

子宮肌瘤是臨床常見的婦科良性腫瘤，主要以下腹部疼痛、墜脹、子宮異常出血等為臨床表現(xiàn)，對婦女生育產(chǎn)生了不良的影響，甚至有部分患者因治療不及時而導(dǎo)致惡性病變[1-2]。目前子宮肌瘤的發(fā)病機制尚無統(tǒng)一定論，有研究認(rèn)為子宮肌瘤是機體激素水平紊亂的產(chǎn)物[3]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤患者外周血清雌孕激素的水平與正常人群水平相仿，但雌孕激素受體的表達(dá)量明顯升高，由此降低雌孕激素受體的水平可能是治療子宮肌瘤的靶向[4-5]。此外，還有學(xué)者認(rèn)為與細(xì)胞增殖/凋亡失常、細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常等因素有關(guān)，經(jīng)典PI3K/AKT信號通路與激素受體調(diào)控機制關(guān)系密切，有研究顯示，激活PI3K/AKT信號通路可增強子宮肌瘤細(xì)胞的侵襲力，導(dǎo)致病情惡化[6]。

桂枝茯苓丸首載于《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁組成，是治療婦人癥病下血的經(jīng)典方，自宋代以來該湯劑的運用范圍逐漸擴展，大量運用于婦科經(jīng)、帶、產(chǎn)、雜等血瘀諸證[7-8]，臨床不乏其有效治療子宮肌瘤的報道[9-10]，但其作用機制尚不明確。基于此，我們探討桂枝茯苓丸的作用機制是否與雌孕激素受體及其重要調(diào)控通路PI3K-AKT有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取90只雌性SD大鼠，鼠齡3～6個月，平均鼠齡（4.5±0.3）個月。購自凱學(xué)生物科技（上海）有限公司，注冊號：91310120MA1HK1JC5H。所有動物均由河南省實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置參數(shù)：溫度（24±0.5）℃，濕度（52±0.5）%。

1.1.2 藥物

苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020529）、桂枝茯苓丸（山西華康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字030225Z56）。

1.1.3 試劑與儀器

全自動生化儀（AU5800，購自美國貝克曼庫爾特公司）;雌激素受體一抗抗體（貨號ab2847，購自Abcam有限公司）;β-actin一抗抗體（貨號ab8226，購自Abcam有限公司），孕激素受體一抗抗體（貨號ab3823，購自Abcam有限公司）;PI3K一抗抗體（貨號ab2835，購自Abcam有限公司）;p-AKT一抗抗體（貨號ab4812，購自Abcam有限公司）;t-AKT一抗抗體（貨號ab5362，購自Abcam有限公司）。桂枝茯苓丸（山西華康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字030225Z56）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

選取90只大鼠并采用數(shù)字隨機法分為空白組、模型組及中藥組，每組30只。各組大鼠在體質(zhì)量、鼠齡各方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。可進(jìn)行組間比較。

模型制備：參考文獻(xiàn)[11]中模型制備方法，具體如下：隔天（周一、周三、周五）對模型組及中藥組大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mg/kg），連續(xù)注射12周，空白組大鼠接受相同時間，等劑量的生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 干預(yù)方法

至第13周開始藥物干預(yù)，中藥組接受桂枝茯苓丸灌胃（根據(jù)人臨床用量換算成1.32 g/mL），其中空白組及模型組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，各組均1次/d，連續(xù)灌胃18 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

子宮濕度及子宮系數(shù)：按照參考文獻(xiàn)[12]的測量方法對各組大鼠子宮濕度及系數(shù)進(jìn)行計算，具體如下：連續(xù)灌胃15 d后從各組大鼠隨機選取6只大鼠，稱重后麻醉斷頭處死后取出子宮，稱得子宮的重量即子宮濕重;子宮系數(shù)=子宮（g）/大鼠體質(zhì)量（g）。

子宮平滑肌厚度變化：干預(yù)結(jié)束后隨機從各組選取6只大鼠，用10%多聚甲醛灌流固定，隨后將子宮組織取出進(jìn)行乙醇、二甲苯脫水，石蠟包埋成塊，修片切片，染色，封片，光鏡下觀察，圖像采集。每個樣本隨機取5個視野進(jìn)行拍片觀察，計算平滑肌層厚度，并計算平均值為最終結(jié)果。

Masson染色病理分析：將所得標(biāo)本切片進(jìn)行Masson染色，并參照文獻(xiàn)[12]對標(biāo)本病理進(jìn)行分級，具體如下：0級：子宮平滑肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，未出現(xiàn)纖維組織增生，平滑肌細(xì)胞核呈紅色，未出現(xiàn)或極少量組織呈藍(lán)色條索狀排列。腺體上皮細(xì)胞均呈單層立方或柱狀排列;Ⅰ級：子宮平滑肌細(xì)胞尚屬規(guī)則，平滑肌層輕度增生，平滑肌細(xì)胞核呈深紅色或深藍(lán)色，可見少量深藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織;Ⅱ級：子宮平滑肌層出現(xiàn)部分增厚，大量平滑肌出現(xiàn)穿插現(xiàn)象，細(xì)胞排列紊亂，平滑肌細(xì)胞核呈深紅色或深藍(lán)色，可見較多深藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織，腺體上皮細(xì)胞均呈單層或復(fù)層立方或柱狀排列;Ⅲ級：子宮平滑肌層出現(xiàn)明顯增厚，平滑肌穿插現(xiàn)象明顯，甚至部分肌層出現(xiàn)旋渦狀，細(xì)胞排列紊亂，平滑肌細(xì)胞核呈深紅色或深藍(lán)色，可見大量深藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織。每個樣本隨機取5個視野進(jìn)行拍片觀察，觀察病理分級情況，并計算平均值為最終結(jié)果。

Western Blotting檢測：干預(yù)結(jié)束后各組隨機選取6只大鼠斷頭后取出子宮組織，稱重后以1∶100比例加入裂解液對組織進(jìn)行充分裂解，隨后將充分裂解的樣本在4 ℃ 12 000 r/min條件下進(jìn)行離心后吸取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白水平測定，將樣本加入事先配制好的電泳凝膠內(nèi)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗后取出生物膜，加入ECL顯影液進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中對顯影結(jié)果進(jìn)行采集及分析。

免疫組織化學(xué)檢測法：干預(yù)結(jié)束后隨機抓取各組6只大鼠腹腔注入10%水合氯醛充分麻醉，隨后用多聚甲醛進(jìn)行固定，取出子宮組織后再進(jìn)行脫水、包埋、切片、固定，隨后將切好的組織片進(jìn)行脫蠟，在進(jìn)行抗原修復(fù)、加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，隨后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，避光環(huán)境下加入DAB溶液進(jìn)行顯色，調(diào)整顯色時間后用自來水將DAB溶液沖洗干凈，封片，顯微鏡下讀片，每張載玻片隨機選擇5個視野進(jìn)行觀察并計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析研究數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗或兩樣本秩和檢驗;組內(nèi)比較采用配對t檢驗或配對秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮濕重、子宮系數(shù)及子宮平滑肌層厚度的比較 與空白組比較，模型組及中藥組的子宮濕重、子宮系數(shù)及子宮平滑肌層厚度明顯增加，中藥組上述指標(biāo)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組子宮病理表現(xiàn) Masson染色顯示空白對照組子宮組織切片著色為紅色，極少量染色纖維組織;模型組大鼠子宮環(huán)行肌和縱行肌可見大量的深藍(lán)色纖維組織，甚至部分肌層組出現(xiàn)明顯的團塊狀纖維結(jié)構(gòu);中藥組大鼠子宮組織的纖維化程度明顯受到抑制。見圖1。

2.3 各組大鼠子宮組織PI3K-AKT信號通路的改變 與空白組比較，模型組及中藥組大鼠子宮組織的PI3K、p-AKT水平上調(diào)，T-AKT各組水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其中中藥組PI3K、p-AKT水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表2。

2.4 各組子宮平滑肌ER及PR表達(dá)情況 與空白組比較，模型組及中藥組子宮平滑肌ER及PR陽性表達(dá)率升高，其中中藥組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表3。

3 討論

子宮肌瘤雖為良性腫瘤，但仍有惡變的可能。中醫(yī)將子宮肌瘤歸納為“癥瘕”等范疇，寒邪入侵機體阻滯胞絡(luò)，隨著腎氣日漸虛弱、沖任失調(diào)最終導(dǎo)致陰陽失衡，隨后產(chǎn)生肝腑失調(diào)，氣血運行不暢而出現(xiàn)凝滯瘀積于胞宮而成此病[14-15]，進(jìn)而出現(xiàn)下腹部疼痛、墜脹、子宮異常出血等臨床癥狀，由此溫中散寒、活血化瘀通絡(luò)是在治療子宮肌瘤的關(guān)鍵。桂枝茯苓丸由張仲景在《傷寒論》中所創(chuàng)，方中桂枝性溫味辛，以其溫中散寒、祛瘀通絡(luò)之功而為君藥;桃仁有活血化瘀之功，可助桂枝行瘀滯化癥結(jié)，為臣藥;牡丹皮和赤芍性微寒味苦，即可活血化瘀有可清熱涼血，此外芍藥還可緩急止痛，以緩解臨床腹部不適之感;茯苓甘淡平，可滲濕健脾以化痰，以增強消瘤散結(jié)之功，此外茯苓可健脾益胃，益氣生血以扶正;上述3藥共為佐藥。諸藥合用共奏活血化瘀、溫通經(jīng)脈、緩消癥結(jié)之功，整方寒溫并用，即可活血化瘀又無耗傷陰血之弊，祛瘀而不傷正[16-18]。本研究將SD雌性大鼠隨機分為3組，利用苯甲酸雌二醇注射液腹腔注射模擬子宮肌瘤病理，連續(xù)用桂枝茯苓丸灌胃后發(fā)現(xiàn)大鼠子宮濕重及子宮平滑肌厚度確有所減少，且通過Masson染色證實桂枝茯苓丸可明顯改善子宮肌瘤模型大鼠的病理等級，進(jìn)一步佐證了桂枝茯苓丸對子宮肌瘤確有理想的療效。

近年來，關(guān)于桂枝茯苓丸有效治療子宮肌瘤的報道較多，但對其作用機制目前仍尚無結(jié)論。大量的資料發(fā)現(xiàn)當(dāng)孕激素水平減少或雌激素作用被拮抗時，孕激素誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的作用將被削弱，由此提示孕激素和雌激素在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過程中有同等重要作用，宮內(nèi)膜的異常增殖導(dǎo)致ER、PR的異常活化，而PR、ER表達(dá)增多可進(jìn)一步誘導(dǎo)激素應(yīng)答細(xì)胞信號傳遞，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖、分化，加速子宮肌瘤細(xì)胞的有絲分裂[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)PR、ER在造模組大鼠子宮組織中高表達(dá)，隨著桂枝茯苓丸的干預(yù)，大鼠PR、ER表達(dá)均有所下降，由此我們認(rèn)為桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤有效的作用機制可能是糾正孕激素和雌激素異常激活有關(guān)。ER表達(dá)的調(diào)控因素復(fù)雜多樣，大量信號通路可通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切等修飾手段對ER的表達(dá)產(chǎn)生影響，其中PI3K/Akt通路備受關(guān)注。PI3K/Akt信號通路被視為介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞活動的重要機制，P13K受到生長因子等活化后將其下游磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇，二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇均是細(xì)胞重要的第二信使因子，激活后進(jìn)一步活化下游的蛋白激酶Akt，介導(dǎo)各種生物學(xué)效應(yīng)，從而導(dǎo)致各種疾病（糖尿病、自身免疫疾病和腫瘤等）的發(fā)生[21-22]。本研究顯示，與空白組比較，模型組及中藥組大鼠子宮組織的PI3K、p-AKT水平上調(diào)，其中中藥組PI3K、p-AKT水平較模型組明顯降低，提示桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤有效的作用機制可能是通過介導(dǎo)PI3K/Akt通路實現(xiàn)的。

總之，桂枝茯苓丸可明顯抑制子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展，其作用機制可能是通過PI3K-AKT信號通路介導(dǎo)孕激素/雌激素受體實現(xiàn)的。

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（2019-02-21收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）