鐵調素抗乙型肝炎病毒活性的初步研究

王兆飛 管世鶴 陳禮文 楊凱 張浩 候舒文 潘正蘭 段元麗 王秀

摘要：目的 初步探究鐵調素抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法 使用鐵調素處理pcDNA1.3轉染的HepG2細胞及pSM2轉染的Huh7細胞，檢測并分析不同時間點鐵調素處理組與未處理組之間培養上清液中HBV-DNA、HBeAg水平的差異。結果 與未處理組比較，pcDNA1.3轉染HepG2細胞鐵調素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05），pSM2轉染Huh7細胞鐵調素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）。與未處理組比較，pcDNA1.3轉染HepG2細胞鐵調素處理組HBeAg表達顯著降低（P<0.05），pSM2轉染Huh7細胞鐵調素處理組HBeAg表達顯著降低（P<0.05）。結論 通過研究我們初步證明了鐵調素具有一定的抑制HBV復制的活性。

關鍵詞：肝炎病毒，乙型;鐵調素;HepG2細胞;Huh7細胞

鐵調素（Hepcidin）是一種由肝臟合成并分泌富含半胱氨酸的生物活性多肽，由于鐵調素在體外研究過程中表現出明顯的抗菌活性屬于高度保守的防御性多肽，作為一種陽離子抗菌多肽鐵調素也被稱為肝臟抗菌多肽（LEAP-1）。鐵調素除在維持鐵穩態中發揮作用外還具有一定的抗菌活性，既往對鐵調素的抗菌活性研究中我們發現，鐵調素通過限制細胞外鐵得獲得，一些細胞以這種“營養免疫”的形式對抗細菌感染。近期另一些研究提出，鐵調素具有不依賴于以往“營養免疫”的形式而獨立影響免疫應答的作用[1]。然而在目前沒有體內研究結論支持的情況下，一些研究報道鐵調素可能通過一種尚未被充分了解的機制抑制炎性細胞因子。然而鐵調素在宿主防御中具有獨立作用都僅是推測性的結論。近期有學者報道體內常量鐵調素未能表現出顯著的免疫學活性，而高濃度鐵調素（濃度為體內常量的數十倍）在體外細胞實驗中表現出一定的免疫學活性[2，3]。并有研究報道體外細胞實驗中高濃度鐵調素可以抑制HCV/HIV病毒復制[4]，而鐵調素能否同樣影響HBV的復制仍未有提及。為此，本課題通過探究高濃度鐵調素對HBV病毒復制的影響，從而明確應用鐵調素治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床價值。

1 研究對象與方法

1.1 儀器與試劑 低溫高速離心機;超低溫冰箱;HBV-DNA病毒定量檢測試劑盒（批號：20180512 R1）;雅培全自動化學發光免疫分析儀（i2000SR）;

1.2 細胞培養與質粒轉染? 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM對HepG2細胞、Huh7細胞（上海富亨細胞庫）在37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞接種于6孔板，調整每孔細胞數約為1×106。取具備乙型肝炎病毒全基因組的pC1.3質粒（pSM2）1.8 μg，混合脂質載體（Thermo Scientific，USA）2μL，靜置20 min，轉染接種于6孔板24 h，繼續培養細胞達到80%融合;在37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后換液，繼續培養定12h、24h、48h取細胞上清液。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析。應用 Kolmogorov-Smirnov檢驗對定量資料進行正態分布檢驗，應用Spearman相關分析對數據進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 鐵調素處理組與未處理不同時間點HBV DNA水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉染HepG2細胞鐵調素處理組在12h時即出現HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2A所示。

與未處理組比較，pSM2轉染Huh7細胞鐵調素處理組在24h時即出現HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2B所示。

2.2 鐵調素處理組與未處理不同時間點HBeAg水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉染HepG2細胞鐵調素處理組在24h時即出現HBeAg表達的下降，在處理48h時HBeAg表達顯著降低（P<0.05）如圖3A所示。

與未處理組比較，pSM2轉染Huh7細胞HBeAg鐵調素處理組在24h時即出現HBeAg表達的下降，在處理48h時HBeAg表達顯著降低（P<0.05）如圖3B所示。

4 討論

據既往研究報道鐵調素在體外實驗中表現出顯著的抗菌活性，并且鐵調素的抗菌活性與它的生理活性相關，具體機制為鐵調素通過降鐵作用導致體內鐵元素的低水平，低鐵環境使得細菌生長繁殖受到這種“鐵營養”缺乏的影響，表現出抑制細菌生長繁殖的活性。所以最初鐵調素抗菌活性正是依靠這種營養性免疫的形式實現的。所以在感染性疾病中鐵調素扮演的角色仍存在爭議。近期研究發現鐵調素在HCV及HIV感染過程中表達受到顯著抑制，在體外實驗中鐵調素可以抑制Huh7細胞中HCV病毒的復制[5]，此外在HIV感染的過程中鐵調素的早期表達對于隨后的病毒載量有著密切聯系，但是這種相關機制尚未明確。于是我們對鐵調素影響HBV復制進行了初步研究。

我們通過模擬HBV感染肝細胞對肝炎、肝癌體外細胞系進行HBV病毒質粒的轉染，并以高濃度的鐵調素加以處理，通過定時測定培養上清液HBeAg、HBV DNA表達水平來了解鐵調素對HBV復制的影響，本研究發現在鐵調素的作用下HBV的復制受到顯著抑制。結合國內外的研究我們對鐵調素抑制HBV復制的具體機制進行了推測，據國外學者對鐵調素抗HCV活性研究的過程中發現，鐵調素的抗病毒活性可能與其對肝細胞內抗病毒狀態的影響相關。在鐵調素處理的肝細胞中IFN的表達不是定向的，但是在鐵調素的作用下肝細胞中一些IFN誘導基因的表達顯著上調，如OAS1和IFIT1（ISG56）。其中已知的IFIT1是影響細胞內抗病毒狀態中的重要蛋白質，而鐵調素刺激上調的IFIT1可能直接參與了鐵調素介導的抗病毒作用。另外，高水平鐵調素可直接導致體內的低鐵環境，并通過這種營養限制的方式導致病毒在胞內的復制繁殖過程受阻，從而表現出對病毒復制抑制效應。以上兩點皆是我們對鐵調素抗HBV活性具體機制的推測，然而由于鐵調素對機體免疫反應的復雜作用，所以這種抗HBV活性的具體機制需要進一步探究。我們的研究初步證明了鐵調素具有一定的抑制HBV復制的活性，也進一步佐證了應用鐵調素對于治療慢性乙型病毒肝炎的臨床價值。

基金：安徽省科技廳重點研究與開發計劃項目（1804h08020236）;安徽省高校自然科學研究項目（KJ2018A0206）;安徽醫科大學第二附屬醫院首批“火花計劃”科研項目（2015hhjh06）

參考文獻：

[1]Sow FB，Florence WC，Satoskar AR，Schlesinger LS，Zwilling BS，Lafuse WP. Expression and localization of hepcidin in macrophages：a role in host defense against tuberculosis. Journal of LeukocyteBiology. 2007;82（4）：934–45.

[2]Peyssonnaux C，Zinkernagel AS，Datta V，Lauth X，Johnson RS，Nizet V. TLR4-dependent hepcidin expression by myeloid cells in response to bacterial pathogens. Blood. 2006;107（9）：3727–32.

[3]Hunter HN，Fulton DB，Ganz T，Vogel HJ. The solution structure of human hepcidin，apeptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. Journal of Biological Chemistry. 2002;277（40）：37597–603.

[4] Lambrecht RW，Sterling RK，Naishadham D，Stoddard AM，Rogers T，Morishima C，et al. Iron levels in hepatocytes and portal tract cells predict progression and outcomes of patients with advanced chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2011;140（5）：1490–500.

[5] Liu H，Trinh T L，Dong H，et al. Iron Regulator Hepcidin Exhibits Antiviral Activity against Hepatitis C Virus. PLoS ONE，2012，7（10）：e46631.

作者簡介：

王兆飛，男，碩士研究生;單位：安徽醫科大學第二附屬醫院 檢驗科，合肥230601

管世鶴，男，教授，主任技師，博士生導師，責任作者，單位：安徽醫科大學第二附屬醫院 檢驗科，合肥230601，E-mail：shiheguan@126.com。