8—O—乙酰山梔子苷甲酸對慢性炎性痛模型大鼠脊髓背角內HDAC1～5表達的影響及與JAK2—STAT3信號通路的關系研究

王健 肖小莉 崔佳 王磊 樊婷婷 張維

中圖分類號 R285；R441.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0608-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.07

摘 要 目的：研究8-O-乙酰山梔子苷甲酸（8-OaS）對慢性炎性痛模型大鼠脊髓背角內組蛋白去乙酰化酶1～5（HDAC1～5）表達的影響及與Janus激酶2-信號轉導與轉錄活化因子3（JAK2-STAT3）信號通路的關系。方法：取SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組（生理鹽水）、完全弗氏佐劑（CFA）組（生理鹽水）和8-OaS低、中、高劑量組（2、20、200 μg/kg），每組6只，除正常對照組和假手術組外，其余各組大鼠左側后足趾側皮下注射CFA復制慢性炎性痛模型，建模后腹腔注射相應藥物，每日1次，連續7 d。采用熱輻射法檢測首次給藥第1、2、3、4、5、6、7、8、11、15天大鼠的縮足潛伏期。另取大鼠按上述后5組方法進行分組給藥，采用Western blot法檢測大鼠末次給藥后腰膨大節段脊髓背角中HDAC1～5、磷酸化JAK2（pJAK2）、磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白表達情況。再另取大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、CFA組（生理鹽水）、8-OaS組（20 μg/kg）和JAK2-STAT3的拮抗藥α-氰基-（3，4-羥基）-N-芐苯乙烯胺（AG490）組（8 mg/kg），每組6只，同上法復制IP模型后腹腔注射相應藥物，每日1次，連續7 d，采用免疫熒光組織化學染色觀察各組大鼠HDAC5和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）在脊髓背角的表達情況。結果：與正常對照組和假手術組比較，其余各組大鼠的縮足潛伏期均明顯縮短（P<0.05）；與CFA組比較，8-OaS低、中、高劑量組大鼠的縮足潛伏期均明顯延長（P<0.05），且呈劑量依賴性。與假手術組比較，CFA組大鼠脊髓背角中HDAC1～5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達均明顯增強（P<0.05）；與CFA組比較，8-OaS低、中、高劑量組大鼠脊髓背角中HDAC5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達均明顯降低（P<0.05），但HDAC1～4蛋白表達差異均無統計學意義（P>0.05）。HDAC5大量表達于星形膠質細胞上，與假手術組比較，CFA組大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表達均明顯增強（P<0.05）；與CFA組比較，8-OaS組和AG490組大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表達均明顯降低（P<0.05）。結論：8-OaS可有效緩解由CFA誘導的慢性炎性痛，其機制可能與下調脊髓背角中HDAC5表達和JAK2、STAT3的磷酸化水平有關。

關鍵詞 8-O-乙酰山梔子苷甲酸；慢性炎性痛；組蛋白去乙酰化酶；星形膠質細胞；Janus激酶2-信號轉導與轉錄活化因子3；大鼠

Study on the Effects of 8-O-acetyl-shanzhiside Methylester on the Expression of HDAC 1-5 in the Spinal Dorsal Horn of Rats with Chronic Inflammatory Pain and Its Relationship with JAK2-STAT3 Signaling Pathway

WANG Jian1，2，XIAO Xiaoli3，CUI Jia1，WANG Lei1，FAN Tingting1，ZHANG Wei1（1.Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University， Xi’an 710032， China；2.Dept. of Ambulatorium， No. 94750 Military Hospital of PLA， Fujian Liancheng 366200， China；3.Dept. of Rheumatology， the Affiliated TCM Hospital of Shanghai University of TCM， Shanghai 200071， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of 8-O-acetyl-shanzhiside methylester （8-OaS） on the expression of histone deacetylase 1-5 （HDAC1-5） in the spinal dorsal horn of chronic inflammatory pain model rats， and its relationship with Janus-activated kinase 2-signal transductions and activators of transcription 3 （JAK2-STAT3） signaling pathway. METHODS： SD rats were randomly divided into normal control group， sham operation group （normal saline）， complete Freund’s adjuvant （CFA） group （normal saline）， 8-OaS low-dose， medium-dose and high-dose groups （2， 20， 200 μg/kg）， with 6 rats in each group. Except for normal control group and sham operation group， chronic inflammatory pain model was induced by subcutaneous injection of CFA into the left hind toe of rats in other groups； after modeling， those groups were given relevant medicine intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 d. Thermal radiation method was used to detect the latency of paw withdraw in rats on the 1st， 2nd， 3rd， 4th， 5th， 6th， 7th， 8th， 11th and 15th day of administration. Rats were grouped and given medicine according to the above method of the latter 5 groups. The protein expression of HDAC 1-5， phosphorylated JAK2 （pJAK2） and phosphorylated STAT3 （pSTAT3） in the spinal dorsal horn of lumbar enlargement segment in rats were detected by Western blot method after last medication. Rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， CFA group （normal saline）， 8-OaS group （20 μg/kg） and JAK2-STAT3 inhibtor AG490 group （8 mg/kg）， with 6 rats in each group； IP model was established by same method as above and then were given relevant medicine intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 d. The expression of HDAC5 and glial fibrillary acidic protein （GFAP） in spinal dorsal horn of rats were detected by immunofluorescence histochemical staining. RESULTS： Compared with normal control group and sham operation group， the latency of paw withdraw was shortened significantly in other groups （P<0.05）. Compared with CFA group， the latency of paw withdraw was prolonged significantly in 8-OaS low-dose， medium-dose and high-dose groups （P<0.05）， in dose-dependent manner. Compared with sham operation group， the protein expression of HDAC 1-5， pJAK2 and pSTAT3 in spinal dorsal horn of rats were increased significantly in CFA group （P<0.05）. Compared with CFA group， the protein expression of HDAC5， pJAK2 and pSTAT3 in spinal dorsal horn of rats were decreased significantly in 8-OaS low-dose， medium-dose and high-dose groups （P<0.05）， but there was no statistical significance in the protein expression of HDAC 1-4 （P>0.05）. HDAC5 was expressed on astrocytes in the spinal dorsal horn； compared with sham operation group， the expression of GFAP and HDAC 5 were increased significantly in spinal dorsal horn of rats in CFA group （P<0.05）. Compared with CFA group， the expression of GFAP and HDAC5 in spinal dorsal horn of rats were decreased significantly in 8-OaS group and AG490 group （P<0.05）. CONCLUSIONS： 8-OaS can effectively relieve CFA-induced chronic inflammatory pain， the mechanism of which may be associated with the down-regulation of HDAC5 expression and the phosphorylation levels of JAK2 and STAT3.

KEYWORDS 8-O-acetyl-safalinoside； Chronic inflammatory pain； Histone deacetylase； Astrocytes； JAK2-STAT3； Rats

慢性疼痛（Chronic pain）是一種不愉快的軀體感覺和情感經歷，與潛在的組織損傷或神經功能紊亂相關[1-2]。慢性疼痛病情遷延不愈，其發生嚴重影響了患者的生活質量和精神狀態，加之缺乏有效的治療方法、鎮痛藥物副作用大等缺點，使該癥成為當前困擾人類健康較嚴重的問題之一[如外傷、神經壓迫、感染及癌癥等導致的慢性炎性痛（Chronic inflammatory pain）][3-4]。既往研究表明，在IP狀態下，大鼠脊髓背角內的膠質細胞和神經元被序貫激活，兩者共同參與了慢性疼痛的發生與發展過程；此外，慢性疼痛的維持可能與星形膠質細胞的關系更為密切，其機制可能與脊髓背角星形膠質細胞內信號轉導與轉錄活化因子3（Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）的激活有關[5]。亦有研究報道稱，骨癌痛模型大鼠脊髓背角膠質細胞活化明顯，組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）表達顯著上調，給予雷公藤內脂醇能夠顯著緩解模型大鼠的痛閾，其機制可能與抑制脊髓背角膠質細胞中HDACs的上調、阻斷膠質細胞激活誘導的神經炎癥有關[6]。由此可見，Janus激酶2-信號轉導與轉錄活化因子3（Janus-activated kinase 2-singal transducers and activators of transcription 3，JAK2-STAT3）信號轉導通路和HDACs在疼痛的發生與發展過程中具有重要意義。

獨一味系藏族習用藥材，為唇形科植物獨一味[Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo]的干燥地上部分。已有研究表明，該藥除傳統的活血止血、祛風止痛作用外，其有效成分8-O-乙酰山梔子苷甲酸（8-O-acetyl-shanzhiside methylester，8-OaS）具有明顯緩解慢性痛的功效[7]。因此，筆者結合疼痛發生的機制及8-OaS的鎮痛特性，探究HDAC1～5與JAK2-STAT3信號轉導通路之間的關系，為臨床慢性炎性痛的治療提供可靠的實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Hargreaves型熱痛儀（美國Stoeling公司）；CM1950型冷凍切片機（德國Leica公司）；TS-1型搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；3K30型低溫離心機（美國Sigma公司）；BX-60型共聚焦激光顯微鏡（日本Olympus株式社會）；PT 1200E型超聲組織勻漿機（路易企業有限公司）；ChemiDocTM MP System 全能型成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

8-OaS（批號：766720，純度：≥97%）、完全弗氏佐劑（CFA，批號：F5881）、JAK2-STAT3的拮抗藥α-氰基-（3，4-羥基）-N-芐苯乙烯胺（AG490，批號：T3434，純度：99.99%）購自美國Sigma公司；小鼠抗膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫球蛋白G（IgG）（美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號：sc-58766）；兔抗酪氨酸蛋白激酶JAK2 IgG、兔抗STAT3 IgG和兔抗HDAC1～5 IgG（美國Cell Signaling Technology公司，批號：3230T、9139S、2062、57156、60538、2072、20458）；Biotin結合的驢抗兔IgG和Cy3標記的親和素（Avidin）（美國Jackson Immuno-Research公司，批號：211-065-109、211-165- 109）；Alexa488結合的驢抗小鼠IgG（美國Jackson Immuno-Research公司，批號：211-545-109）；辣根過氧化物酶（HRP）結合的驢抗小鼠IgG、HRP結合的驢抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：SC-2064、ZDR-5308）；小鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）IgG（美國Sigma公司，批號：A1978）；10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）（美國Bio-Rad公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）；組織裂解液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：BL1357）；增強化學發光（ECL）液（北京拜爾迪診斷技術有限公司，貨號：K-12045-D50）。

1.3 動物

二級清潔級健康SD大鼠，♂，體質量約220～250 g，由空軍軍醫大學動物實驗中心提供[實驗動物生產許可證號：SCXK（軍）2012-0007]。所有大鼠于恒溫22～25 ℃下飼養，并保證12 h的光照，可自由攝取水和食物。所有的實驗均在空軍軍醫大學動物研究倫理委員會批準下進行。

2 方法與結果

2.1 造模

大鼠分別于左側后足趾側皮下注射CFA 50 μL構建慢性炎性痛模型[8]，假手術大鼠同法注射50 μL生理鹽水，正常對照大鼠不做處理。

2.2 8-OaS的鎮痛效果

2.2.1 分組與給藥 取大鼠隨機分為正常對照組、假手術組（生理鹽水）、CFA組（生理鹽水）和8-OaS低、中、高劑量組（2、20、200 μg/kg），每組6只。CFA和8-OaS的給藥劑量設定依據本研究組既往研究[8-9]。除正常對照組大鼠全程不做任何處理外，其余各組大鼠均從造模后第1天開始腹腔注射相應藥物進行干預，每日1次，連續7 d。每次給藥時間嚴格控制在同一時間范圍（一般安排在行為學測試之后），實驗過程安排同一人進行操作。

2.2.2 行為學測試 采用熱輻射法檢測各組大鼠給藥第1、2、3、4、5、6、7、8、11、15天的縮足潛伏期。測試前將Hargreaves熱痛儀基礎溫度調至37 ℃，將所有實驗大鼠放入罩有透明罩的有機材料檢測實驗臺上，待適應20 min時，將熱光源發射器對準大鼠左側足底注射部位，啟動開關并開始計時，仔細觀察在照射的過程中若大鼠出現縮左足行為則被視為陽性，同時關閉發射器開關并讀取時間，記為縮足潛伏期，否則視為陰性。出現陽性行為的時間誤差值控制在0.1 s范圍內，檢測時間不能超過30 s，避免損傷大鼠后足。

2.2.3 數據處理與測定結果 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間比較采用配對t檢驗。結果顯示，與正常對照組和假手術組比較，其余各組大鼠的縮足潛伏期均明顯縮短（P<0.05）。與CFA組比較，8-OaS低、中、高劑量組大鼠的縮足潛伏期均明顯延長（P<0.05），且呈劑量依賴性。各組大鼠的縮足潛伏期測定結果見圖1。

2.3 8-OaS干預狀態下HDAC1～5及JAK2-STAT3信號通路的表達

2.3.1 分組與給藥 取大鼠隨機分為假手術組、CFA組和8-OaS低、中、高劑量組，每組6只，給藥方法同“2.2.1”項。

2.3.2 Western blot法檢測HDAC1～5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達 各組大鼠末次給藥后，腹腔注射水合氯醛（280 mg/kg），待深麻醉后迅速開胸并搭建體外循環灌注通道，用事先預冷的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）快速沖去體內流動的循環血，并于冰塊上均勻分離腰膨大節段脊髓背角，加至提前溶解了磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的組織裂解液中。使用超聲組織勻漿機低溫勻漿裂解，吸取勻漿裂解液至1.5 mL離心管中，于4 ℃下、以12 000 r/min離心5 min，使用BCA法對離心管中的上清液進行蛋白定量，并進行10%的SDS-PAGE電泳分離，并將分離后的蛋白轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入一抗[兔抗HDAC1～5 IgG（稀釋比例： 1 ∶ 200）、兔抗pJAK2（稀釋比例：1 ∶ 300）、pSTAT3（稀釋比例：1 ∶ 300）及小鼠抗GFAP IgG（稀釋比例：1 ∶ 800）、小鼠抗β-actin IgG（稀釋比例：1 ∶ 500）]，于4 ℃下孵育12 h后，用TBST溶液清洗3次，每次10 min，分別加入HRP結合的驢抗兔IgG和HRP結合的驢抗小鼠IgG（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于室溫下孵育1～2 h后，用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，添加ECL液后置于成像系統下掃描熒光條帶，采用Image Lab 5.1軟件分析光密度值，以β-actin為內參，以相應蛋白與內參的光密度比值表示相應蛋白的相對表達量。

2.3.3 數據處理與測定結果 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，單因素方差分析比較各組大鼠蛋白定量數據的差異，邦弗朗尼（Bonferroni）事后檢定/檢驗法檢驗組間差異。結果顯示，與假手術組比較，CFA組大鼠脊髓背角中HDAC1～5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達均明顯增強（P<0.05）。與CFA組比較，8-OaS低、中、高劑量組大鼠脊髓背角中HDAC5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達均明顯降低（P<0.05），HDAC1～4蛋白表達差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠脊髓背角中HDAC1～5、pJAK2、pSTAT3蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表1。

2.4 8-OaS是否通過抑制JAK2-STAT3信號通路的激活影響HDAC5的表達

2.4.1 分組與給藥 取大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、CFA組（生理鹽水）、8-OaS組（20 μg/kg）和AG490組（8 mg/kg），每組6只。給藥方法同“2.2.1”項。AG490的給藥劑量設定依據本研究組既往研究[10]。

2.4.2 免疫熒光組織化學染色檢測GFAP、HDAC5表達 大鼠末次給藥后，腹腔注射水合氯醛（280 mg/kg），待深麻醉后迅速開胸灌注沖去機體內流動的循環血液，加入固定液（含pH為7.2～7.4的PBS和4%多聚甲醛）固定。取出腰膨大節段置于上述固定液中繼續固定2 h后，以4 ℃、30%蔗糖溶液脫水48 h，用冷凍切片機橫切（厚度為20～30 μm），用PBS清洗3次，每次5 min，隨后用5%山羊血清室溫封閉2 h，滴加小鼠抗GFAP IgG（稀釋比例：1 ∶ 800）和兔抗HDAC5 IgG（稀釋比例：1 ∶ 200），于室溫下孵育1 h后，再于4 ℃下孵育48 h，用PBS清洗3次，每次5 min，加入Biotin結合的驢抗兔IgG（稀釋比例：1 ∶ 500），于室溫下孵育6 h；PBS再次漂洗5 min×3次后，于室溫滴加Alexa488標記的驢抗小鼠IgG和Cy3標記的Avidin（稀釋比例均為1 ∶ 500 ），室溫放置4 h，PBS再次漂洗5 min×3次后于暗光下將薄片置于載玻片上，待水分自然蒸發后以熒光封片劑封片，使用共聚焦激光顯微鏡觀察GFAP與HDAC5的雙重標記情況，定量分析GFAP與HDAC5表達情況。

2.4.3 數據處理與測定結果 統計方法同“2.3.3”項。結果顯示，HDAC5大量表達于星形膠質細胞上。與假手術組比較，CFA組大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表達均明顯增強（P<0.05）；與CFA組比較，8-OaS組和AG490組大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表達均明顯降低（P<0.05）。大鼠脊髓背角中GFAP與HDAC5表達的熒光圖見圖3，電泳圖見圖4，測定結果見表2。

3 討論

本實驗基于前期研究探索8-OaS對慢性炎性痛的改善情況及機制探討[9]。通過CFA足趾側皮下注射構建慢性炎性痛模型，采用Western blot法檢測8-OaS干預后大鼠脊髓背角內HDAC1～5的表達改變。之后通過免疫熒光雙標染色方法觀察到脊髓背角內HDAC5與星形膠質細胞的標記物GFAP大量共存；Western blot結果進一步提示腹腔給予8-OaS能夠顯著抑制JAK2-STAT3胞內信號轉導通路。加用JAK2-STAT3的拮抗藥AG490后結果顯示，8-OaS通過降低JAK2-STAT3胞內信號轉導通路的磷酸化進一步實現對HDAC5的抑制從而達到對星形膠質細胞活化的抑制作用。

當外周組織或神經受損時，脊髓背角內小膠質細胞和星形膠質細胞會相繼被活化，活化的膠質細胞會釋放大量的趨化因子，募集膠質細胞釋放更多的炎癥因子，加劇脊髓背角的炎癥反應，這些炎癥因子結合神經元上的相應受體可活化神經元，促進慢性疼痛的發生與發展[11-14]。既往研究證實，小膠質細胞主要在慢性疼痛形成階段達到活化高峰，星形膠質細胞于慢性疼痛穩定時激活明顯[5]。因此，抑制星形膠質細胞的活化對慢性疼痛的緩解顯得尤為重要。作為神經系統數量較多的細胞之一，星形膠質細胞主要對神經元起到營養、支持以及維持脊髓背角微環境穩定的作用。

HDACs是一類核內蛋白酶，主要對染色體的結構和基因表達具有修飾和調控的作用[15]。組蛋白乙酰化程度的改變能夠影響相關基因的表達。而組蛋白去乙酰化水平則發揮相反的作用。既往研究表明，HDACs在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用，參與腫瘤細胞的增殖、分化以及轉移，并且給予HDACs的抑制劑能夠發揮明顯的抗腫瘤特性[16-17]。亦有研究報道稱，HDACs的上調有助于改善脊髓背角膠質細胞的病理變化和骨癌引起的慢性疼痛，其機制可能是通過抑制脊髓背角膠質細胞中HDACs的上調，然后阻斷膠質細胞激活誘導的神經炎癥[18]。結合上述資料，本實驗研究結果提示，HDAC1～5參與了CFA誘發慢性炎性痛的過程，且慢性炎性痛時其表達明顯增強。腹腔給予8-OaS后，可顯著緩解CFA誘發的熱痛閾，HDAC5作為HDAC1～5中唯一改變的蛋白分子，其表達和星形膠質細胞的激活均得到顯著抑制，從而阻礙了慢性炎性痛的發生與發展，這符合筆者設想的HDAC5與星形膠質細胞與慢性炎性痛的形成密切相關。

有研究發現，慢性疼痛時，脊髓背角星形膠質細胞內的STAT3磷酸化水平會顯著提高，并且給予STAT3的抑制劑可觀察到大鼠術側痛閾明顯增加[5]。當JAK2信號分子在白細胞介素6（IL-6）等促炎癥因子作用下發生磷酸化時，緊接著其下游分子STAT3也會發生磷酸化。而磷酸化的STAT3分子會影響細胞因子信號轉導抑制蛋白3（SOCS3）、細胞因子以及干擾素（IFN-α、IFN-β）等分子表達[19]。在本實驗中，筆者給予慢性炎性痛模型大鼠JAK2-STAT3信號轉導通路的拮抗藥AG490進行人為干預，觀察到AG490在分子水平上不僅可以降低JAK2和STAT3的表達，還可以間接抑制HDAC5的表達，說明JAK2- STAT3信號通路參與了慢性炎性痛的形成，并與HDAC5的抑制相關。

8-OaS作為傳統中藥獨一味的有效成分之一，其藥理活性強，抗炎性質穩定。目前在臨床上，獨一味作為一種口服抗炎藥被廣泛應用。本研究組前期結果顯示，鞘內給予8-OaS可以有效緩解大鼠IP癥狀，其機制可能與8-OaS抑制了脊髓背角內的炎癥反應有關[8]。本研究結果表明，8-OaS能夠顯著緩解IP，鎮痛時間持續久，且呈劑量依賴性。其次，HDAC1～5參與了IP的形成，而8-OaS可以特異性下調HDAC5的表達進而影響星形膠質細胞的活化，并且給予JAK2-STAT3信號轉導通路的拮抗藥AG490后效果與單獨給予8-OaS相當，故推測8-OaS可能通過抑制JAK2-STAT3信號轉導通路的激活下調了HDAC5的表達，但具體機制有待研究的進一步深入。并且8-OaS是否還可能通過其他途徑影響星形膠質細胞的活化有待進一步探究。本研究存在一定的局限性，雖然在CFA誘導的IP模型大鼠中未見HDAC1～4的改變，但該研究尚未在JAK2-STAT3信號轉導通路抑制后，研究HDAC1～4的表達情況，設計上缺乏嚴謹性，無法全面排除實驗的偶然性，在之后的實驗研究過程中需要注意。

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（收稿日期：2018-09-04 修回日期：2018-12-14）

（編輯：鄒麗娟）