Box—Behnken響應面法結合多指標綜合評分法優選柴胡安心膠囊的水提工藝

王玲嬌 郝玉佩 劉坤申 楊繼章 孫國祥 于靜

中圖分類號 R932；R283；R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0632-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.11

摘 要 目的：優化柴胡安心膠囊的水提工藝。方法：以提取液中沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素的含量和出膏率的綜合評分值為考察指標，以加液倍數、浸泡時間、回流時間、提取次數為因素，在單因素試驗基礎上運用Box-Behnken響應面法對柴胡安心膠囊的水提工藝進行優化并進行驗證試驗。結果：最優提取工藝為加11倍水、浸泡10 h，提取2次，每次回流1.5 h；驗證試驗中3批樣品提取后的綜合評分值（91.37%）與預測值（91.38%）相比較，相對誤差為1.87%（RSD<2%，n=3）。結論：優選的提取工藝方法簡單、結果穩定，可用于后續柴胡安心膠囊的制劑生產。

關鍵詞 柴胡安心膠囊；有效成分；Box-Behnken響應面法；多指標；綜合評分；水提工藝；優化

Optimization of Water Extraction Technology of Chaihu Anxin Capsules by Box-Behnken Response Surface Method Combined with Multi-index Comprehensive Scoring Method

WANG Lingjiao1，HAO Yupei1，LIU Kunshen2，YANG Jizhang1，SUN Guoxiang3，YU Jing1（1.Dept. of Pharmacy， the First Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050031， China；2.Dept. of Cardiology， the First Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050031， China；3.College of Pharmacy， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the water extraction technology of Chaihu anxin capsules. METHODS： Taking comprehensive scoring value of the contents of gallic acid，chlorogenic acid，puerarin，glycoside，rutin，cinnamic acid， quercetin and the yield of extract as investigation index， using multiple of adding liquid， soaking time， reflux time and extraction times as factors， water extraction technology of Chaihu anxin capsule was optimized by Box-Behnken response surface method based on single factor test. Validation test was conducted. RESULTS： The optimal extraction technology of Chaihu anxin capsules was adding 11 times of water， soaking for 10 h， extracting for 2 times， refluxing for 1.5 h each time. In validation test， the relative deviation of comprehensive scoring value to predicted value was 1.87% for 3 batches of samples （RSD<2%， n=3）. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology is simple， stable and suitable for further production of Chaihu anxin capsules.

KEYWORDS Chaihu anxin capsules； Active ingredients； Box-Behnken response surface method；Multi-index； Comprehensive scoring； Water extraction technology； Optimization

柴胡安心膠囊為河北醫科大學第一醫院根據多年臨床經驗處方制成的醫院制劑（批準文號：冀藥制字Z20060013），主要由柴胡、葛根、白芍、桂枝、夏枯草等14味藥材組成，具有疏肝理氣、鎮靜安神、調和營衛之功效，主治焦慮抑郁和心臟神經官能癥[1]。在該制劑組方中，君藥為葛根，其可辛涼解肌、生津止渴，主要活性成分為葛根素、大豆苷等黃酮類化合物[2-3]，具有擴張血管、降低血壓、改善微循環、保護心肌細胞、增加纖溶活性、降低血黏度等作用[4-5]。臣藥為白芍和桂枝，白芍可養血斂陰、柔肝止痛；桂枝可溫通經脈、解表通陽；兩藥合用則可柔肝斂陰、益陽通脈、調和營衛；其中白芍含有芍藥苷等單萜類成分和沒食子酸等成分[6-7]，具有鎮痛、鎮靜、解痙、抗炎、抗潰瘍、調節免疫、擴張血管、耐缺氧等作用；桂枝含有肉桂酸、桂皮醛等成分[8-9]，具有擴張血管、抗氧化、降血脂等作用。佐藥夏枯草歸肝膽經，可清利肝經郁熱、升清降濁、散結消腫，主要成分為蘆丁、槲皮素、綠原酸等黃酮類化合物[10-11]，具有降壓、抗抑郁的作用。本研究根據處方中各藥材有效成分的理化性質及藥理作用，以葛根素、大豆苷、沒食子酸、綠原酸、槲皮素、肉桂酸和蘆丁7個有效成分的含量、出膏率為指標進行綜合評價[12-13]，采用響應面法[14]對柴胡安心膠囊的水提工藝進行優選，為后續制劑的生產提供改進依據。

1 材料

1.1 儀器

1200 Series高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Sartorius BS 110S分析天平[Sartorius科學儀器（北京）有限公司]；KQ-400KDE高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸（批號：17062510，純度：≥98%）、大豆苷（批號：17060913，純度：≥98%）、肉桂酸（批號：20171102，純度：≥98%）、葛根素（批號：17072302，純度：≥98%）、綠原酸（批號：17081021，純度：≥98%）對照品均購自上海士鋒生物科技有限公司；蘆丁（批號：20130809，純度：≥98%）、槲皮素（批號：20121205，純度：≥98%）對照品均購自大連美侖生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為市售娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

柴胡（批號：180601CP254）、白芍（批號：180601CP- 072）、龍骨（批號：20180101）、夏枯草（批號：20180401）、延胡索（批號：20160901）、炙甘草（批號：20180101）等藥材均購自河北新祁中藥顆粒飲片有限公司；葛根（批號：18031901）、清半夏（批號：18070701）、珍珠母（批號：18011501）、干姜（批號：18011601）等藥材均購自國藥樂仁堂河北藥業有限公司；桂枝（批號：180601CP252）、茯苓（批號：180601CP212）、牡蠣（批號：180501CP154）、大棗（批號：171201CP611）等藥材均購自河北萬修藥業有限公司；上述所有藥品經河北醫科大學大學第一醫院張一民主管中藥師鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）的藥用標準。

2 方法與結果

2.1 7個有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.5%乙酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～40 min，5%→25%B；40～60 min，25%→60%B；60→80 min，100%B）；檢測波長：275 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。分別取“2.1.2”和“2.1.3”項下供試品溶液和混合對照品溶液進樣分析，結果，各相鄰峰間分離度均大于 1.5，理論板數按葛根素峰計不低于4 000。2種溶液的色譜圖見圖1。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取提取后的浸膏（試驗號28）0.5 g，加入約50 mL的50%乙醇回流1.5 h，過濾，殘渣中加入50 mL的50%乙醇繼續回流1.5 h，重復2次，合并3次濾液，減壓濃縮至約15 mL，加50%乙醇定容至25 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品30 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻得對照品溶液。分別稱取大豆苷、沒食子酸、綠原酸、肉桂酸、蘆丁、槲皮素對照品17、7、21、12、21、18 mg，用甲醇稀釋并定容于25 mL量瓶中，與葛根素對照品溶液混勻后作為混合對照品溶液備用。

2.1.4 線性關系與定量限考察 分別量取“2.1.3”項下的混合對照品溶液8、4、2、1、0.5 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，進樣分析，記錄色譜圖。以色譜峰面積為縱坐標（y）、待測物質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x）繪制標準曲線，得到沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素回歸方程分別為y=5 486.6x+52.33（r=0.999 5）、y=3 187.9x+26.08（r=0.999 1）、y=4 260.7x+70.97（r=0.999 3）、y=4 985.7x+66.92（r=0.999 7）、y=1 807.4x-1.22（r=0.999 4）、y=3 634.4x+23.31（r=0.999 8）、y=1 969.5x+51.80（r=0.999 5）。結果表明 ，沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素檢測質量濃度線性范圍分別為1.78～28.52、5.25～84.00、18.72～299.66、4.24～67.86、3.02～48.39、5.27～84.35、4.52～72.39 μg/mL。按相關方法操作，得定量限分別為1.78、5.25、18.72、4.24、3.02、5.27、4.52 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液，連續進樣6次。分別計算沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素峰面積的RSD，結果分別為 0.77%、0.86%、2.30%、1.12%、1.04%、1.33%、2.06%（n=6）。

2.1.6 穩定性試驗 精密稱取“2.1.2”項下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣分析。分別計算沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素峰面積的RSD，結果分別為1.04%、1.96%、1.53%、0.93%、0.96%、1.12%、1.66%（n=6）。

2.1.7 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，進樣測定。分別計算沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、蘆丁、肉桂酸、槲皮素峰面積的RSD，結果分別為1.28%、1.96%、2.25%、1.66%、1.35%、1.58%、2.58%（n= 6）。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液9份，分別加入沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、肉桂酸、蘆丁、槲皮素對照品適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，計算平均回收率和RSD，結果均符合要求，詳見表1。

2.2 出膏率的測定

精密量取水提工藝篩選試驗中的水提液50 mL，置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干后于105 ℃干燥至恒質量；置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算出膏率[出膏率（%）=干膏質量×50/藥材質量×100%]。

2.3 水提工藝考察因素與指標的確定

本研究在考察提取工藝時，設計在單因素試驗基礎上結合響應面法對各因素與指標進行優化。根據前期試驗結果，確定柴胡安心膠囊處方的藥效部位為水溶性部分，因此對其水提工藝進行考察。根據預試驗結果，選擇對水提效果可能有影響的因素，即加液倍數、浸泡時間、回流時間、提取次數作為考察因素。采用層次分析法（AHP）進行分析[15]，由于柴胡安心膠囊中葛根為君藥，白芍和桂枝為臣藥，故葛根中主要有效成分葛根素和大豆苷與白芍中的代表性成分沒食子酸比較，葛根素和大豆苷相對重要，記為3.00；由于夏枯草為佐藥，與其有效成分蘆丁、槲皮素、綠原酸比較，葛根素和大豆苷則更為重要，則記為7.00；另外，出膏率與葛根素和大豆苷比較同等重要，故與沒食子酸比較時也記為3.00；按照AHP法以此類推，各指標權重的判斷矩陣見表2。

采用AHP計算，最終確定沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、肉桂酸、蘆丁、槲皮素及出膏率的權重系數分別為0.064 7、0.029 7、0.254 8、0.254 8、0.081 9、0.029 7、0.029 7、0.254 8。進而根據權重系數計算綜合評分（Y）=ΣDiJ×權重，DiJ=某指標值/某指標值中的最大值，即Y（%）=DiJ沒食子酸×0.064 7+DiJ綠原酸×0.029 7+DiJ葛根素×0.254 8+DiJ大豆苷×0.254 8+DiJ肉桂酸×0.081 9+DiJ蘆丁×0.029 7+ DiJ槲皮素×0.029 7+DiJ出膏率×0.254 8。

2.4 水提工藝篩選的單因素試驗

2.4.1 加液倍數考察 按處方比例稱取藥材207 g，分別加入6、8、10、12、14倍藥材量的水浸泡10 h，回流2次，每次1.5 h，考察提取液的Y值。結果顯示，加液量為6～10倍水時，Y值呈上升趨勢，10倍之后趨于平緩，且10倍與12倍的結果相差不大，考慮生產中的實際操作，選取加液倍數10為響應面試驗設計的考察水平，具體結果見圖2A。

2.4.2 浸泡時間考察 按處方比例稱取藥材207 g，加10倍水，回流2次，每次1.5 h，考察浸泡6、8、10、12、14、18 h后提取液的Y值。結果顯示，浸泡10 h內Y值呈上升趨勢，10 h后開始下降，考慮生產實際操作和藥材變質時間，選擇浸泡10 h為響應面試驗設計的考察水平，具體結果見圖2B。

2.4.3 回流時間考察 按處方比例稱取藥材207 g，加入10倍水，浸泡10 h，回流2次，分別考察回流1、1.5、2、2.5 h后提取液的Y值。結果顯示，回流1～1.5 h時Y值呈上升趨勢，2 h時Y值下降，2.5 h時又上升，但低于1.5 h時的Y值。考慮生產實際操作，選取回流1.5 h為響應面試驗設計的考察水平，具體結果見圖2C。

2.4.4 提取次數考察 按處方比例稱取藥材207 g，加10倍水，回流1.5 h，分別考察回流1、2、3、4次后提取液的Y值。結果顯示，回流1、2、3次時Y值呈上升趨勢，但2次及以后的Y值趨于平緩，考慮生產實際操作，取回流2次為響應面試驗設計的考察水平，具體結果見圖2D。

2.5 水提工藝優化的響應面法

2.5.1 試驗設計 采用Box-Behnken響應面試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選擇浸泡時間（A，h）、提取次數（B）、加液倍數（C）、回流時間（D，h）為考察因素，按1倍處方量稱取藥材207 g進行試驗。

2.5.2 試驗結果與方差分析 以沒食子酸、綠原酸、葛根素、大豆苷、肉桂酸、槲皮素、蘆丁的含量及出膏率為考察指標，按照不同權重系數進行加權計算得到各提取液的Y值，試驗結果見表4。

采用Design-expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到Y對浸泡時間（A）、提取次數（B）、加液倍數（C）、提取時間（D）的回歸方程為Y=91.38+1.22A+2.33B+5.55C+3.93D+2.30AB-1.65AC+4.38AD+2.10BC+0.07BD+1.01CD-4.67A2-4.53B2-3.11C2-8.22D2，R2=0.940 7。方差分析結果見表5。

由表5可知，模型F=5.93，P=0.001<0.01，說明回歸模型極其顯著，失擬項F=3.84，P=0.103 2>0.05，說明模型失擬項不顯著，可以用于分析試驗數據。由表中P值可知，模型的一次項影響順序是C>D>B>A，C、D極其顯著，交互項均不顯著，二次項A2、D2均極其顯著，C2不顯著。

2.5.3 工藝優化結果 運用Design-expert 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸擬合，得到響應面圖，見圖3。

由響應面圖的陡峭程度可知，加液倍數和回流時間對Y值影響較大，交互項對Y值無顯著影響，忽略交互作用，以Y值的回歸模型的極值分析得到最優條件為：浸泡時間為10.00 h，提取次數2.03，加液倍數11.08，回流時間1.50 h，在此條件下Y的預測值為91.38%，考慮生產實際操作，將最優提取條件調整為加液倍數11，浸泡10 h，提取2次，每次回流1.5 h。

2.5.4 驗證試驗 稱取10倍處方量的藥材2 070 g，共3份，按上述優選條件即浸泡時間為10 h、提取2次、加液倍數11、每次回流1.5 h進行驗證試驗。結果，3次試驗的Y值平均為91.37%（RSD<2%，n=3），與預測值相比較，相對誤差為1.87%，說明該模型預測性擬合度良好，所得數據有效可靠，具有一定的實際指導意義，具體結果見表6。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

柴胡安心膠囊由多味中藥組成，若只選擇單一成分為考察指標，則其并不能夠全面反映復方中藥制劑的本身特點，且易受其他因素的影響，單一成分在藥材中的含量與在制劑中的含量不一定呈現真實的線性關系，而各指標之間也可能存在相互影響，故采用多成分的含量為指標來評價復方中藥制劑的工藝優化勢在必行。在該制劑中，柴胡雖為君藥之一，但其主要有效成分柴胡皂苷類的紫外最大吸收波長在210 nm左右，于本研究中的液相檢測條件下基線干擾嚴重，故暫未將該成分的含量列入指標性成分中，但通過選入另一君藥葛根，以及臣藥桂枝和白芍，佐藥夏枯草的7種有效成分，再結合真空干燥后的出膏率，基本上能反映該組方的制劑質量和提取效率。

在設定各指標的權重系數上，本研究根據中藥的君臣佐使理論，運用AHP法計算了8個指標成分的權重，進而得到綜合評分，由此兼顧了藥效與有效成分的提取效率，因此所優化的工藝參數更符合臨床實際情況。

3.2 試驗方法與提取方法的選擇

響應面法與正交試驗法、均勻試驗設計法比較，前者兼顧了多個影響因素以及因素之間的交互作用，故預測結果與真實結果比較更為接近，能夠更精確地獲取到試驗的最優條件[16]。另外，在提取方法上，本試驗從傳統的中藥煎煮法考慮，采用了水提方式，試驗步驟簡單穩定，通過單因素試驗的結果確定對結果產生主要影響的因素和水平，并用于后續響應面試驗的設計，由此提高了結果的準確性，驗證試驗也證明實驗室數據與擴大樣本10倍量后的中試生產結果比較接近，故本研究可為后續柴胡安心膠囊的制劑生產提供試驗依據。

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（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2018-12-04）

（編輯：劉 萍）