肉蓯蓉治療骨質疏松作用機制的網絡藥理學研究

王延濤 楊智華 陳怡 麥喆钘 黃嘉華 孫治中 周馳 李偉寬

中圖分類號 R932；R966 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0645-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.14

摘 要 目的：采用網絡藥理學方法研究肉蓯蓉治療骨質疏松的作用機制。方法：通過檢索中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）獲取肉蓯蓉的活性成分，采用反向分子對接服務器DRAR-CPI及相關數據庫GeneCards、OMIM篩選肉蓯蓉活性成分治療骨質疏松的作用靶標；采用軟件Cytoscape構建肉蓯蓉的“成分-靶標”網絡，結合數據庫String和Cytoscape繪制靶標間相互作用關系；通過服務器Systems Dock WebSite將靶標與活性成分進行分子對接評估二者間的結合活性以進行驗證；最后再利用數據庫DAVID對靶標基因進行基因本體分類富集分析與京都基因與基因組百科全書通路富集分析。結果：從肉蓯蓉中篩選出的活性成分有13個，主要為毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等；活性成分作用的潛在靶標有43個，主要有成骨分化特異性轉錄分子2（RUNX2）、血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素6（IL-6）、骨生長蛋白因子（BGP）、腫瘤壞死因子（TNF）等；靶標作用涉及的信號通路有多條，主要為WNT（Wingless/Integrated）、VEGF、TNF等。結論：本研究初步探討并驗證了肉蓯蓉治療骨質疏松的主要靶標和通路，為后續進一步研究其作用機制奠定了基礎。

關鍵詞 肉蓯蓉；骨質疏松；網絡藥理學；活性成分；靶標；分子對接；信號通路

Network Pharmacology Exploration of the Mechanism of Cistanche deserticola in the Treatment of Osteoporosis

WANG Yantao1，YANG Zhihua2，CHEN Yi3，MAI Zhexing2，HUANG Jiahua3，SUN Zhizhong3，ZHOU Chi4，LI Weikuan1（1.General Department， Guangzhou Panyu District Hospital of TCM， Guangzhou 511400， China； 2.Second Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；3.First Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；4.Hip Protection Ward， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510115， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Cistanche deserticola in the treatment of osteoporosis by network pharmacology. METHODS： The active components of C. deserticola were retrieved and obtained by TCM system platform （TCMSP）. Reverse molecular docking server DRAR-CPI and related databases GeneCards and OMIM were used to screen the target of C. deserticola active ingredients in the treatment of osteoporosis. The “component-target”network of C. deserticola was constructed by Cytoscape software， and the interaction between targets was plotted by String database and Cytoscape software. The combination activity of target and active ingredient was evaluated via molecular docking with Systems Dock WebSite server. GO classification and enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted for target genes using DAVID database. RESULTS： Totally 13 active ingredients were screened out from C. deserticola， such as verbascoside， leonurine， geniposidic acid. There were 43 active ingredient-treated potential targets， such as RUNX2， VEGF， IL-6， BGP， TNF. Multiple signaling pathways were involved in target action， such as WNT （Wingless/Integrated）， VEGF， TNF. CONCLUSIONS： This study preliminarily explores and validates the main targets and pathways of C. deserticola in the treatment of osteoporosis， which lay the foundation for further study of its mechanism.

KEYWORDS Cistanche deserticola； Osteoporosis； Network pharmacology； Active ingredients； Target； Molecular docking； Signaling pathways

骨質疏松（Osteoporosis，OP）是一種好發于中老年人的系統性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的顯微結構破壞為主要特征。因患者的骨質脆性增加，其發生骨折的風險大大增加，輕微的外傷即可導致骨折[1-2]。骨質疏松及其嚴重的并發癥，給患者及其家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔，同時也嚴重地影響著患者的生活質量[3]。據統計，我國老年人口總數已占總人口數的13.26%[4]。因此，探究療效更好、更安全的治療骨質疏松的方法顯得非常必要。目前對于骨質疏松的治療主要采取藥物治療，包括以化學藥為主的骨吸收抑制藥、骨形成制劑、鈣劑和維生素D等[5]。另外，中醫藥治療骨質疏松的報道也較多，其中尤以肉蓯蓉為主要組方藥材[6-9]。

肉蓯蓉味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效，常常用于治療由腎陽虧虛、精血不足所引起的病證[10]。近來，也有動物實驗表明其對阿爾茨海默病模型大鼠有保護作用[11]。現代藥理研究結果表明，肉蓯蓉可以提高骨質疏松模型大鼠血清堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素及鈣離子水平，促進大鼠成骨細胞骨形成蛋白2（BMP2）的表達，加快骨髓間充質干細胞的增殖，促使大鼠成骨細胞合成ALP等，從而達到治療骨質疏松的作用[12-14]。但目前對于肉蓯蓉治療骨質疏松的作用機制研究尚停留在單項的細胞試驗與動物實驗上，難以詳細地探究其更全面的作用機制。

網絡藥理學以生物信息學、系統生物學、多向藥理學、計算機科學等多個學科的技術和知識為基礎，可多層次、全面地闡明藥物治療疾病的作用機制，使研究更能體現整體性和系統性[15]。由于網絡藥理學強調從多靶標、多途徑進行分析，這與中藥及其復方中多成分、多靶標治療疾病的特點不謀而合[16]。因此，本研究采用網絡藥理學的方法，研究分析肉蓯蓉的化學成分、作用靶標以及信號通路，并進行基因本體（Gene ontology，GO）分類富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通過構建肉蓯蓉治療骨質疏松的“成分-靶標-通路”網絡，從整體性角度揭示肉蓯蓉多靶標、多通路的作用網絡，為進一步探究其治療骨質疏松的作用機制提供參考依據。

1 資料

本研究使用的數據庫及相關分析平臺見表1。

2 方法

2.1 化學成分的獲取與活性成分的篩選

于TCMSP 中以“肉蓯蓉”作為關鍵詞，搜索獲取肉蓯蓉所含的所有化學成分信息。以口服利用度（OB）大于30%、類藥性（DL）大于0.18作為限定條件[17]，篩選同時符合上述2個條件的成分作為活性成分。利用Pubchem檢索上述活性成分，得到各成分的3D結構并以mol2格式保存。

2.2 活性成分作用靶標及骨質疏松作用靶標的獲取

本研究利用基于蛋白-配體相互作用親合性函數的DRAR-CPI，使用該服務器通過分子對接預測各成分可能對應的靶標，并依據對接的緊密性進行打分[18]。具體操作如下：將“2.1”項檢索所得肉蓯蓉所有活性成分的mol2格式文件上傳至DRAR-CPI ，選取Z-score<-0.5[19]的靶點作為肉蓯蓉活性成分的潛在靶點。利用 UniProt知識庫的 UniProt Knowledgebase搜索功能，導入肉蓯蓉作用的蛋白靶點的靶蛋白編號（PBD ID），限定物種為“人”，經過檢索和轉化操作，得到肉蓯蓉活性成分的相應靶標。

利用GeneCards數據庫和OMIM數據庫，以“Osteoporosis”或“OP”作為關鍵詞檢索，在數據庫中收集與骨質疏松相關的靶標。將所得靶標與肉蓯蓉活性成分的靶標進行對比，以此篩選出共同的靶標。

2.3 “成分-靶標”網絡構建與分析

將“2.1”項得到的肉蓯蓉的活性成分和“2.2”項收集的治療骨質疏松的靶標導入 Cytoscape 軟件中，構建肉蓯蓉的“成分-靶標”網絡。

2.4 靶標相互作用網絡的構建與分析

利用String 數據庫進行蛋白質之間及與預測蛋白質之間相互作用的搜索[20]。將肉蓯蓉的蛋白靶標導入 String 數據庫，限定物種為“人”，獲取肉蓯蓉治療骨質疏松的潛在靶標間的相互關系。利用Cytoscape 軟件，繪制蛋白相互作用網路，用Cytoscape的工具NetworkAnalyzer進行網絡分析，將節點大小和顏色設置為用于反映 Degree（連接度，即在網絡中通過該點的邊的個數）值的大小，邊的粗細設置為用于反映結合分數的大小，最終獲得靶標間的相互作用網絡。

2.5 分子對接

利用Systems Dock WebSite 進行網絡藥理學的預測和分析，研究配體對復雜的分子網絡的作用。該服務器主要通過Dock-In評分（平臺內置評分功能）的分子對接功能評估蛋白-配體結合活性[21]，故可利用其得到相互作用網絡中的Degree值，對Degree值排名前5的分子與肉蓯蓉的活性成分進行分子對接驗證。之后保存分子對接結果，并對其進行Docking Score 評分，用以評價肉蓯蓉活性成分與靶標之間的結合活性。

2.6 生物過程與通路分析

利用DAVID為大規模的基因或蛋白提供系統而綜合的生物功能注釋信息的功能，獲取最顯著富集的生物學注釋[22]。即在DAVID中，對肉蓯蓉的作用靶標進行 GO通路和KEGG 通路富集分析，保存結果。其中，GO通路富集分析可分為細胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）和生物過程（Biological process，BP）3部分。設定閾值 P<0.05，并按照涉及的靶標數目多少進行排序，篩選前20名的生物過程或通路，利用GraphPad Prism 繪制GO通路分析與KEGG通路分析圖。

2.7 “成分-靶標-通路”網絡構建

分析“2.6”項中排名前20的作用靶標的KEGG通路，結合文獻檢索，篩選出可能與治療骨質疏松密切相關的通路，獲取富集在這些通路上的肉蓯蓉治療骨質疏松的潛在靶標，并與相應的活性成分相對應，構建肉蓯蓉治療骨質疏松的“成分-靶標-通路”多維網絡關系圖。

3 結果

3.1 肉蓯蓉活性成分分析

在TSCMP數據庫中，以OB值大于30%、DL值大于0.18為篩選條件，收集肉蓯蓉的活性成分，其中符合條件的活性成分共有13個，包括益母草堿、右旋喇叭茶醇、去咖啡?；惾~升麻苷、京尼平酸等。另外，本研究還選擇了部分OB值低于30%，但含量較高，具有較高藥理研究價值的活性成分，如橙花醛、蝙蝠葛堿、毛蕊花糖苷等。

3.2 潛在靶標預測

在服務器DRAR-CPI中檢索肉蓯蓉13個活性分子對應的潛在靶標，共得到258個，去除重復靶標后，共得137個潛在靶標。通過與GeneCards、OMIM數據庫中與骨質疏松相關靶標的對比，篩選出抗骨質疏松的可能潛在靶標43個，其主要是成骨分化特異性轉錄分子2（RUNX2）、血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素6（IL-6）、骨生長蛋白因子（BGP）等。

3.3 “成分-靶標”網絡構建

通過將肉蓯蓉活性成分和潛在靶標的相關信息輸入軟件Cytoscape中，構建肉蓯蓉的“成分-靶標”網絡，見圖1。

在圖1中，共含有節點56個，邊線185條。六邊形節點即代表肉蓯蓉活性成分，圓形節點代表潛在的靶標。邊線代表活性成分與潛在靶標的相互關聯。由此圖可知，同一活性成分可以作用于不同靶標，同一靶標也可對應不同活性成分，體現出肉蓯蓉治療骨質疏松具有多成分、多靶標的特點。

3.4 靶標間相互作用網絡的構建

通過數據庫String獲取肉蓯蓉活性分子與骨質疏松相關靶標的相互關系，并將數據導入軟件Cytoscape中構建靶標間相互作用網絡，見圖2。

由圖2可知，靶標間相互作用網絡中包含節點59個，邊線453條。其中圓形節點代表靶標，邊線代表靶標之間的相關性，節點的面積大小表示靶標的Degree值大小，節點面積越大，顏色越深，表示其Degree值越大。通過比較Degree值的大小，并結合現有的研究結果，推測肉蓯蓉抗骨質疏松與RUNX2、VEGF、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、BGP 這5個靶標有關。

3.5 分子對接

選取靶標相互作用網絡中Degree值最大的5個靶標即RUNX2、VEGF、IL-6、TNF、BGP，將其名稱輸入軟件System Dock WebSite，并與肉蓯蓉的13個活性分子進行分子對接，5個靶標Docking Score值-活性成分數量結果見圖3。

由圖3可知，在肉蓯蓉13個活性分子與5個靶標的對接中，共有6個（占9%）的Docking Score值大于7，36個（占55%）的Docking Score值在5.0～7.0之間，18個（占28%）的Docking Score值在4.25～5.0之間，5個（占8%）的Docking Score值小于4.25。一般認為，Docking Score值大于4.25表示分子與靶標具有一定的結合能力，大于5.0表示結合能力較強，大于7.0表示結合能力很強[23]。因此，肉蓯蓉的活性成分與靶標之間具有良好的結合能力。

3.6 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析

對肉蓯蓉活性分子的對應靶標進行GO分類富集分析和KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，篩選出富集基因數量較大的通路和生物過程。CC分析結果見圖4，MF分析見圖5，BP分析見圖6，KEGG通路富集分析結果見圖7。

由圖4～圖6可見，在CC分析結果中，富集基因數量較大的有內涵體通路、頂端質膜通路、膜筏通路、髓鞘通路等；在MF分析結果中，富集基因數量較大的有蛋白酪氨激酶活性通路、肝素結合通路、細胞因子活性通路、蛋白結合通路等；在BP分析結果中，富集基因數量較大的有內皮細胞遷移負調控通路、一氧化氮介導信號轉導通路、血管收縮調節通路、鈉離子轉運調節通路等。由圖7可見，在KEGG通路富集分析結果中，WNT（Wingless/Integrated）信號通路、核轉錄因子κB（NF-κB）受體活化因子（RANK）信號通路、叉頭轉錄因子（FoxO） 信號通路、環磷酸腺苷（cAMP） 信號通路等與肉蓯蓉治療骨質疏松的潛在靶標的相關性明顯。

3.7 “成分-靶標-通路”網絡構建

綜合GO通路和KEGG通路富集分析的結果，篩選出可能具有抗骨質疏松作用的通路，并將其與肉蓯蓉的活性分子和相應的潛在靶標一一對應，即活性分子與靶標對應，靶標與可能通路對應，從而構建出肉蓯蓉治療骨質疏松的“成分-靶標-通路”網絡，見圖8。

如圖8所示，肉蓯蓉治療骨質疏松的活性成分主要有益母草堿、毛蕊花糖苷、去咖啡?；惾~升麻苷、京尼平酸等8個，這些活性成分作用的靶標有RUNX2、IL-6、BGP、TNF、VEGF、結締組織生長因子（CTGF）、過氧化物酶增殖激活受體（PPAR）-γ等32個，這些靶標主要被包含在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、VEGF、WNT、TNF等7條信號通路中。

4 討論

4.1 肉蓯蓉治療骨質疏松的文獻來源

肉蓯蓉是寄生在沙漠樹木梭梭根部的列當科寄生植物，具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功效[24]。《神農本草經輯注》[25]中提到肉蓯蓉“主五勞七傷，補中，除莖中寒熱痛，養五臟，強陰，益精氣，婦人癥瘕”；相關研究表明[26]，肉蓯蓉可降低相關因子的陽性表達，具有一定的抗骨質疏松作用，但與其相關的機制仍待研究。因此，研究肉蓯蓉抗骨質疏松的分子作用機制有較大的意義。

4.2 主要活性成分分析

本次研究收集到肉蓯蓉中具有抗骨質疏松的化學成分主要有毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等。研究表明，肉蓯蓉中的毛蕊花糖苷可以作為抗再吸收劑，通過阻斷破骨細胞活化來減少骨質流失[27]。肉蓯蓉中的益母草苷堿可通過抑制NF-κB和磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）信號通路抑制破骨細胞生成并預防與雌激素缺乏相關的骨質疏松癥[28]。京尼平酸參與激活成骨細胞促進骨生成的相關步驟，并抑制破骨細胞活性以抑制骨質溶解[29]。

4.3 主要靶標分析

本次研究發現，肉蓯蓉可通過對BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶標進行作用來達到抗骨質疏松的作用。多項研究顯示，BGP可影響骨代謝、促進骨吸收，從而對骨質疏松的發生產生影響[30]； TNF-α通過激活PI3K/Akt信號傳導而協同促進RANK配體（RANKL）誘導的破骨細胞形成。此外，CTGF表達的下降可促進人骨成形蛋白2（BMP-2）誘導的成骨細胞分化，CTGF的表達與調節成骨細胞分化有密切關系[31]。PPAR-γ作為PPAR基因家族的轉錄因子，與PPAR-β /δ不同，其可減少骨保護素（OPG）的表達和成骨細胞介導的增加破骨細胞生成等作用[32]。結合本研究結果，推測肉蓯蓉可能通過提高體內TNF、BGP、ALP的水平或上調CTGF、PPAR-γ的表達來發揮抗骨質疏松作用。

4.4 主要通路分析

本次研究結果顯示，與肉蓯蓉治療骨質疏松相關的通路有WNT、VEGF、IL-6等。其中，WNT通路的表達可增加成骨細胞的成骨活性和礦化能力[33]，且另有相關的基礎研究證實[34]，WNT可促進β-連環蛋白結合Lef1/Tcf轉錄因子，并改變基因表達以促進成骨細胞的擴增和功能。間充質干細胞中VEGF的表達升高會導致成骨細胞增加和脂肪細胞分化的減少，并調節二者之間的均衡比例[35]。RUNX2是成骨細胞分化和骨形成的關鍵調節通路，對MSCs成骨細胞譜系有著重大的作用[36]。而IL-6的表達可誘導破骨細胞活化、增強破骨細胞活性[37]，可顯著促進人成骨細胞、內皮細胞和單核細胞的增殖，以及人內皮細胞的遷移[38]。

綜上，本研究通過網絡藥理學的研究方法，分析肉蓯蓉在抗骨質疏松治療方面的有效活性成分和分子機制，結果顯示肉蓯蓉中具有治療骨質疏松作用的化學成分可能是毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等。此成分可能通過BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶標及WNT、VEGF、IL-6等信號通路發揮活性作用。另外，通過相關網絡圖的構建，可直觀地顯示出肉蓯蓉治療骨質疏松具有多成分、多途徑共同作用的特點，符合中醫藥治療疾病的特色，相比化學藥的單基因-單靶點的作用機制，更有優勢。且本研究通過分子對接驗證了網絡藥理學數據的可靠性，但需要注意的是，本研究結果只是一種分子機制上的預測探討，藥物具體作用機制的確認仍需通過進一步的實驗來驗證。

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（收稿日期：2018-10-09 修回日期：2018-12-19）

（編輯：劉 萍）