蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對(duì)腦中動(dòng)脈阻塞—再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)功能損傷的改善作用及機(jī)制研究

烏蘭圖雅 特格喜白音 玉蘭 圖雅

中圖分類號(hào) R285.5；R29 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）05-0652-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.15

摘 要 目的：研究蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對(duì)腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)功能損傷的改善作用及機(jī)制。方法：將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、新黑蘇嘎烏日勒組（540 mg/kg）、化學(xué)藥陽性對(duì)照組（尼莫地平片，16.12 mg/kg）、中藥陽性對(duì)照組（銀杏葉片，5.18 mg/kg），每組16只；除假手術(shù)組外，其余各組大鼠采用Zea-Longa線栓法復(fù)制腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型；造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥1 h后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分；采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑法計(jì)算各組大鼠腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)；蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化；免疫組化染色法檢測(cè)各組大鼠腦前額葉腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)和BDNF、NGF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列松散，形狀不規(guī)則，部分胞體皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，核仁消失。與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學(xué)藥陽性對(duì)照組、中藥陽性對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞核圓整，細(xì)胞質(zhì)染色均勻。結(jié)論：蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對(duì)腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)功能損傷具有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能與增加BDNF及NGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蒙藥；新黑蘇嘎烏日勒；腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷；大鼠；機(jī)制

Study on Improvement Effect of Neurological Impairment and Mechanism of Mongolian Medicine New Hesugawurile on Middle Cerebral Artery Occlusion-reperfusion Injury Model Rats

Wulantuya1，Tegexibaiyin2，Yulan3，Tuya4（1.Dept. of Five Traditional Therapies and Rehabilitation， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；2.Innovative Mongolian Medicine Engineering Research Center， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；3.Dept. of Five Traditional Therapies and Encephalopathy， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；4.Dept. of Gastroenterology， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect of neurological impairment and mechanism of Mongolian medicine New Hesugawurile on middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury model rats. METHODS： Totally 80 rats were randomly divided into sham operation group， model group， New Hesugawurile group （540 mg/kg）， chemical drug positive control group （Nimodipine tablet， 16.12 mg/kg） and TCM positive control group （Ginkgo biloba leaves tablet， 5.18 mg/kg）， with 16 rats in each group. Except for sham operation group， middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury model was estbalished by Zea-Longa suture method in other groups. After modeling， administration group was given relevant medicine intragastrically， while sham operation group and model group were given same volume of distilled water intragastrically， for consecutive 14 d. 1 h after last medication， neurological impairment score was conducted in each group. Cerebral infarction rate， cerebral water content and cerebral indexes were calculated by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride method. The pathological changes of cerebral hippocampal neurons of rats were observed by HE staining. The expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） and nerve growth factor （NGF） protein in prefrontal lobe of rats were observed by immunohistochemical staining. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological impairment score， cerebral infarction rate， cerebral water content， cerebral index， the expression of BDNF and NGF protein were significantly rised in model group （P<0.01）； the cerebral hippocampus neurons were loosely arranged， irregular in shape， while some of them shrank， nissl bodies in the cytoplasm decreased and the nucleoli disappeared. Compared with model group， the neurological impairment score， cerebral infarction rate， cerebral water content and cerebral indexes were decreased significantly in New Hesugawurile group， chemical drug positive control group and TCM positive control group （P<0.05 or P<0.01）， and the expression of BDNF and NGF protein in prefrontal lobe of rats were rised significantly （P<0.05 or P<0.01）. The cerebral hippocampus neurons were arranged tightly， with round nucleus and uniform cytoplasmic staining. CONCLUSIONS： Mongolian medicine New Hesugawurile can improve the neurological impairment of cerebral artery occlusion-reperfusion injury model rats， the mechanism of which may be associated with the expression up-regulation of BDNF and NGF protein.

KEYWORDS Mongolian medicine； New Hesugawurile； Middle artery occlusion-reperfusion injury； Rats； Mechanism

缺血性腦中風(fēng)是由于腦組織局部供血?jiǎng)用}血流灌注減少或血流完全中斷、停止供血供氧，而引起的偏癱和意識(shí)障礙[1]。我國傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥在治療缺血性腦中風(fēng)上具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)并取得了良好的治療效果，蒙藥新黑蘇嘎烏日勒是內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）烏蘭圖雅主任醫(yī)師根據(jù)《蒙醫(yī)金貴》[2]經(jīng)典組方黑蘇嘎-25味丸制成的治療缺血性腦中風(fēng)的有效方劑，主要成分為石決明、麝香、紅花、訶子、黑云香等，具有活血化瘀、清熱解毒、疏通白脈、祛黃水的作用，可用于治療缺血性腦中風(fēng)患者的半身不遂、面部歪斜、手足麻木、言語不清等。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)[3]，新黑蘇嘎烏日勒在臨床上治療缺血性腦中風(fēng)具有良好的效果。由于其作用機(jī)制尚不明確，缺少實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。因此，筆者采用改良Zea-Longa線栓法復(fù)制腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠，探究蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能損傷的改善作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MGC-350電熱恒溫培養(yǎng)箱（蘇州澳爾利烘箱電熱設(shè)備制造有限公司）；ZA120R4電子天平（上海贊維衡器有限公司）；BX53光電顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；BPH-600數(shù)字式pH計(jì)（上海日島科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

新黑蘇嘎烏日勒（內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心，批號(hào)：20160345，規(guī)格：60丸/袋）；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ33125，規(guī)格：30 mg/片）；銀杏葉片（湖南華納大藥廠股份有限公司，批號(hào)：170210，規(guī)格：19.2 mg/片）；水合氯醛（北京市旭東化工廠，批號(hào)20000530）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F7038619）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：5091034）；兔抗鼠免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：1502289706）；無水乙醇（批號(hào)：20140823）、二甲苯（批號(hào)：20150706）均購自沈陽市新化試劑廠；多聚甲醛（批號(hào)：F20161203）、枸櫞酸鈉（批號(hào)：20120709）、枸櫞酸（批號(hào)：20130507）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）試劑盒（批號(hào)：20161203）、神經(jīng)生長因子（NGF）試劑盒（批號(hào)：20161115）均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠80只，♀，體質(zhì)量190～220 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。購入后分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃、相對(duì)濕度為40%～60%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、新黑蘇嘎烏日勒組（540 mg/kg，根據(jù)臨床用藥劑量換算而得）、化學(xué)藥陽性對(duì)照組（尼莫地平片，16.2 mg/kg，根據(jù)臨床用藥劑量換算而得）、中藥陽性對(duì)照組（銀杏葉片，5.18 mg/kg，根據(jù)臨床用藥劑量換算而得），每組16只。各組大鼠采用改良Zea-Longa線栓法復(fù)制腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型[4]，用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射充分麻醉，分離結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈剪開小口，插入栓線，將栓線向頸內(nèi)動(dòng)脈插入約（18.0±2.0） mm，松開動(dòng)脈夾，并于分叉處結(jié)扎，缺血90 min后，將栓線抽離，確認(rèn)無出血后乙醇消毒，涂青霉素粉，縫合皮膚；假手術(shù)組僅在動(dòng)脈處備線處理，不造模。造模成功后各組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d。假手術(shù)組和模型組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

末次灌胃給藥1 h后，參照文獻(xiàn)[5]方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分：無神經(jīng)功能損傷癥狀，0分；提尾時(shí)對(duì)側(cè)肢體屈曲內(nèi)收，1分；一側(cè)肢體抵抗力下降并有Ⅰ級(jí)癥狀，2分；自由活動(dòng)時(shí)向癱疾側(cè)劃圈并有Ⅱ級(jí)癥狀，3分；意識(shí)喪失、不能行走，4分。

2.3 腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)的測(cè)定

神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)束后，各組隨機(jī)選取10只大鼠，參考文獻(xiàn)[6-7]方法，斷頭處死大鼠，取出大腦，剝?nèi)ツX膜、小腦和腦干，用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗，濾紙吸干表面水分并稱質(zhì)量；于-20 ℃冰箱冷凍10 min后，取出大腦，切取2 mm厚度冠狀位腦片，切成5片，放入1%TTC的溶液中，37 ℃溫箱孵育20 min染色；經(jīng)染色后的正常腦組織呈玫瑰紅色，腦梗死組織呈灰白色。孵育完后，將腦片置于10%甲醛中固定24 h，取出，稱腦片濕質(zhì)量；剝離梗死組織，并稱其質(zhì)量。將正常腦組織和梗死組織放入烘箱，105 ℃烘12 h至恒質(zhì)量后，取出，稱腦片干質(zhì)量，然后計(jì)算大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)。腦梗死率（%）=（梗死組織質(zhì)量/腦片濕質(zhì)量）×100%，腦含水率（%）=（腦片濕質(zhì)量-腦片干質(zhì)量）/腦片濕質(zhì)量×100%，腦指數(shù)（%）=大腦質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.4 大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)觀察

神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)束后，各組取剩余6只大鼠用10%水合氯酸（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，開腹暴露心臟，灌注針刺入左心室，剪開右心耳，0.9%生理鹽水沖洗，再用4%多聚甲醛灌流固定，直至大鼠身體逐漸僵硬震顫[8]，再斷頭，于視交叉平面前后2～5 mm處冠狀切開大腦，取中間部分置于4 ℃、4%多聚甲醛中固定24 h，再乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，顯微鏡觀察大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化。

2.5 大鼠腦前額葉BDNF和NGF 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取大鼠腦組織，用10%甲醛固定，24 h后組織常規(guī)脫水包埋，切片60 ℃烘烤過夜，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2溶液孵育10 min，沖洗，于檸檬酸鈉緩沖鹽溶液中高壓修復(fù)5 min，室溫條件下血清封閉15 min，棄血清；然后按免疫組化試劑盒說明書操作，其中一抗為大鼠BDNF抗體（1 ∶ 100）和NGF抗體（1 ∶ 150），二抗為兔抗鼠IgG抗體（1 ∶ 100）。顯微鏡觀察BDNF和NGF 蛋白表達(dá)，采用Image J軟件對(duì)經(jīng)免疫組化染色后的大腦切片進(jìn)行灰度值分析[9]，并計(jì)算積分光密度（IOD）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學(xué)藥陽性對(duì)照組、中藥陽性對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著顯著降低（P<0.01）。

3.2 大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)的測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學(xué)藥陽性對(duì)照組、中藥陽性對(duì)照組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)觀察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密層次清晰，細(xì)胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞胞漿、核染色均勻；模型組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則，部分胞體皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，核仁消失。與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學(xué)藥陽性對(duì)照組、中藥陽性對(duì)照組大鼠腦海馬細(xì)胞排列相對(duì)整齊緊密，細(xì)胞核較為圓整，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，病理改變與模型組相比有所減輕。各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

3.4 大鼠腦前額葉BDNF和NGF蛋白表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學(xué)藥陽性對(duì)照組、中藥陽性對(duì)照組大鼠腦前額葉BDNF、NGF表達(dá)顯著增加（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達(dá)的免疫組化見圖2，各組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見表3。

4 討論

新黑蘇嘎烏日勒為我院用于治療缺血性腦中風(fēng)的常用方劑，課題組前期也進(jìn)行了其治療缺血性腦血管病的臨床研究[3]。由于本研究內(nèi)容重點(diǎn)未涉及量效關(guān)系評(píng)價(jià)，因此，本實(shí)驗(yàn)只設(shè)置了一個(gè)臨床療效最佳的生物等效劑量組作為考察對(duì)象，并于預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)其結(jié)果較為理想，最后確定540 mg/kg為最優(yōu)劑量。尼莫地平片用于急性腦血管病恢復(fù)期的血液循環(huán)改善，療效確切[10-11]，故在本研究中作為化學(xué)藥陽性對(duì)照組。銀杏葉片是從植物中提取的有效成分，臨床常用于中風(fēng)、半身不遂、腦梗死等[12]，故在本研究中作為中藥陽性對(duì)照組。

腦中風(fēng)臨床主要表現(xiàn)為神志障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、癱瘓；運(yùn)動(dòng)障礙是由于上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，失去了對(duì)下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的抑制調(diào)控作用，臨床上主要表現(xiàn)為肌張力增高，呈痙攣性癱瘓[13]。中樞性癱瘓是由于錐體束受損[14]而產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)障礙；周圍性癱瘓[15]又稱下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元性癱瘓，是因脊髓前角細(xì)胞及腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核受損害產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)障礙，由于下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，使其所支配的肌肉張力降低，反射減弱或消失。本研究模型組與假手術(shù)組比較，神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著增加，說明大鼠腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷未自然恢復(fù)；治療后新黑蘇嘎烏日勒組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低，說明新黑蘇嘎烏日勒可改善模型大鼠的神經(jīng)功能損傷。

腦是對(duì)缺氧最敏感的器官，腦組織缺血將會(huì)引起局部腦組織功能損傷，其損傷程度與缺血時(shí)間長短有關(guān)，短期缺血會(huì)引起可逆性損傷，長時(shí)間的缺血會(huì)引起梗死，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫及腦細(xì)胞壞死[16-20]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笾委熀螅潞谔K嘎烏日勒組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數(shù)顯著降低，提示新黑蘇嘎烏日勒對(duì)腦梗死損傷具有改善作用。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)神經(jīng)元的生長發(fā)育起重要作用[21-23]。BDNF能防止神經(jīng)元受損傷死亡、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化，是中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持正常生理功能所必需的神經(jīng)營養(yǎng)因子[24]。NGF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長發(fā)育，維持神經(jīng)元的存活[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，新黑蘇嘎烏日勒組BDNF、NGF的表達(dá)相比模型組顯著增加，模型組BDNF、NGF表達(dá)相比假手術(shù)組也有明顯增加，推測(cè)模型組是由于自我修復(fù)引起的增加，而新黑蘇嘎烏日勒組增加得更顯著，進(jìn)而說明新黑蘇嘎烏日勒組具有促進(jìn)修復(fù)的作用；提示新黑蘇嘎烏日勒可通過增加BDNF、NGF表達(dá)，促進(jìn)中樞神經(jīng)元的生長發(fā)育及受損傷神經(jīng)元的再生及分化，改善大鼠腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷。

綜上所述，蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對(duì)大鼠腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠具有良好的改善作用，其作用機(jī)制可能與增加腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達(dá)有關(guān)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及參考。

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（收稿日期：2018-09-28 修回日期：2018-12-30）

（編輯：唐曉蓮）