云南地區非小細胞肺癌外周血EGFR基因突變檢測分析

崔靜 楊麗琳 宋蜀伶 方虹 強 潘鑫艷

【摘 ???要】 ???目的：探討云南地區非小細胞肺癌（NSCLC）患者外周血中表皮因子生長受體（EGFR）基因突變情況。方法：收集2017年10月-2019年7月本院云南地區晚期NSCLC患者外周血標本37例，運用ARMS-Taqman 探針法檢測標本中EGFR 基因突變情況。結果：37例血液標本中，14例（37.8%）存在EGFR基因突變，其中19Del占總突變的28.6%（4/14），L858R 占總突變的42.8%（6/14），L858R、19Del占總突變的71.4%（10/37），有2例同時存在L858R、T790M突變;2例同時存G719X、S768I 雙突變14.3%（2/14）;2例存在L861Q突變14.3%（2/14）。結論：云南地區外周血EGFR 基因突變檢測率與國內其他報道一致，主要以EGFR基因L858R及19Del突變為主;但云南地區的S768I 則明顯高于其他地區。

【中圖分類號】R821.4+2 ???【文獻標識碼】A ???【文章編號】1004-7484（2019）04-0091-02

肺癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的80%～90%，惡性程度高。在我國，肺癌已成為惡性腫瘤第一死因，而云南省的肺癌發病率與死亡率一直在國內位居榜首，特別是云南宣威地區，發病率是全國平均水平的20倍。70%～80%的NSCLC患者確診時已處于晚期，失去了手術治療或根治性放療的機會，晚期NSCLC全身化療中位生存期僅為8～10個月。隨著對肺癌生物標志物的深入研究和致病機理的逐步闡明，分子靶向治療已經成為肺癌綜合治療中的最新模式，受到廣泛關注。目前NSCLC治療的重要方向之一是以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點的分子靶向治療。EGFR基因突變主要發生在18～21外顯子， 大量臨床研究顯示檢測EGFR基因突變可以篩查對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）靶向藥敏感的患者，從而實現靶向個體化治療。

但是臨床上常由于多種原因，如肺癌病理組織標本過少、患者病情過重無法耐受獲取組織標本的相關檢查，創傷大，操作繁瑣等，導致無法進行組織學EGFR 突變檢測，從而缺乏使用EGFR-TKIs治療的依據。近年來，NSCLC患者的外周血循環DNA分析可一定程度反映腫瘤情況，其檢測得到了廣泛關注。研究發現腫瘤患者外周血腫瘤DNA含量明顯高于正常人群，且外周血腫瘤DNA 與腫瘤組織DNA 具有類似的遺傳學特性，有數據顯示血液EGFR水平與組織樣本的一致性為60%～95%。楊長紹等對云南地區NSCLC患者組織標本的EGFR基因突變進行了檢測，發現了具有顯著的地區差異性，本文就云南地區NSCLC患者外周血中的EGFR基因突變情況進行檢測分析。

1 ???材料和方法

1.1 臨床資料

本院自2017年10月至2019年7月共收治37例僅有細胞學標本但無組織學標本、僅行外周血EGFR突變檢測的Ⅳ期非小細胞肺癌患者。其中男20例，女17例;年齡36～69歲，中位年齡55歲;有吸煙史者20例，無吸煙史者26例;腺癌36例。

1.2 外周血EGFR檢測方法

1.2.1 標本采集

常規采血10 ml，用一次性真空采血管（游離DNA保護專用） 接采血針收集血樣10 ml，立即輕柔地上下顛倒采血管8～10次，并于4 h內提取游離DNA。

1.2.2 血漿分離

全血4000 rpm 離心10 min，取上清（吸取時槍尖離底部殘留物2～3 mm），此上清即為血漿（≥2 ml） 。

1.2.3 DNA提取

取4 ml血漿樣品（不少于3 ml），加入1.8 ml Buffer CDL，再加入50μl蛋白酶K液，充分混勻10 s， 63℃水浴消化15 min。快速冷卻至室溫，加入400μl DNA Tracer 混勻，再加入3.3ml 預冷的異丙醇，顛倒混勻，10000 rpm 離心5 min，棄上清;往沉淀中加入470μl Buffer CDB 與10μl蛋白酶K液，63℃消化10 min，快速冷卻至室溫，加入200μl無水乙醇，將沉淀吹打混勻。將沉淀混合液全部轉移至吸附柱中，10000 rpm 離心30 s，棄廢液。加入700 μl Buffer CW1， 10000 rpm 離心30 s;加入700 μl Buffer CW2， 10000 rpm 離心30 s，;加入700 μl 無水乙醇，10000 rpm 離心30 s，更換收集管， 13000 rpm 離心5 min;將吸附柱轉移至干凈的1.5 ml離心管中，往吸附膜中心滴加50 μl Buffer CDE，90℃孵育5 min， 13000 rpm 離心1 min，收集樣品DNA。

1.2.4 DNA濃度測定

用微量紫外分光光度測定DNA 樣品的濃度及OD260/OD280值。

1.2.5 ARMS法進行PCR 擴增

人EGFR基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司。取42.3 μl 樣品DNA，加入2.7 μl Taq 酶（EGFR） ，混勻后向每個反應管內加入5μl。將8連排反應條蓋上蓋子，離心后放入實時定量PCR儀中。每輪反應設置陰陽對照各一。擴增程序： 95℃ 5 min; 95℃25 s， 64℃ 20 s，72℃ 20 s，15 個循環; 93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s， 31 個循環，在60℃時收集FAM/VIC 熒光信號。

1.2.6 結果判定

陰性對照無信號，陽性對照Ct值<20。待測樣品內控、外控信號應升起，外控信號應在13～19。滿足上述條件的試驗結果為可信結果。突變Ct值≥陰性臨界值時為（-），<陽性臨界值為強（+）。當突變Ct值≥陽性臨界值且<陰性臨界值時，計算△Ct值（△Ct 值=突變Ct值-外控Ct值）。若△Ct值<相應的△Ct Cut-off 值，則該樣品為弱（+）;若△Ct值>相應的△Ct Cut-off值，則該樣品為（-）。

2 ???結果

2.1 血漿DNA質量控制

用微量紫外分光光度儀測定DNA 樣品的濃度，平均濃度為11.02 ngμl，平均OD260/OD280 比值為1.96。

2.2 EGFR基因突變頻率與類型

云南地區37例中血液標本中，14例（37.8%）存在EGFR 基因的突變，其中EGFR基因外顯子21 L858R突變率最高，為42.8%（6/14）;其次為19 缺失突變（28.6%，4/14）;19Del、L858R 占總突變的71.4%（10/14）;2例患者（14.3%，2/14）同時出現外顯子18 G719X 和外顯子20 S761I 雙突變， S761I無獨立突變，與18外顯子G719X伴隨存在;2例患者（14.3%，2/14）同時出現外顯子20 T790M 和外顯子21 L858R 突變;2例患者出現外顯子21 L861Q突變（14.3%，2/14）。

3 ???討論

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）酪氨酸激酶受體抑制劑（tyrosine kinases inhibitors， TKIs）是目前最重要的靶向治療藥物，對于有EGFR敏感突變的NSCLC，采用EGFR-TKIs治療具有明顯的臨床療效。然而，肺癌組織活檢樣本具有局限性，如很多高齡患者診斷時已無法手術因而無標本可取，氣管鏡取材小，某些腫瘤解剖位置及肺部基礎疾病不適和穿刺，穿刺本身諸多風險，反復取材患者接受程度低等。“液體腫瘤學檢測”因其操作可行性強、侵害性小、具有實時動態等特點正越來越受到臨床關注。循環腫瘤DNA（ctDNA） 是凋亡和壞死的腫瘤細胞直接釋放到外周血中的DNA 片段，并攜帶腫瘤組織相關信息。朱毅等報道NSCLC 患者外周血EGFR突變與組織中EGFR突變的一致率為92%。研究發現福爾馬林固定及石蠟包埋技術對樣本DNA 的會產生一定的影響，每個樣本腫瘤細胞的數量與形態和取樣的位置及大小存在很大關系，加上腫瘤異質性，導致腫瘤病理組織活檢可能不能反映整個病灶的完整信息。外周血中的ctDNA 來源于腫瘤原發灶和轉移灶壞死凋亡的腫瘤細胞碎片，這就可能可以避免腫瘤組織的遺傳異質性而體現整個腫瘤的遺傳學特征。研究表明在中國EGFR 基因的突變存在顯著的地域差異，臺灣地區的EGFR 基因的突變以外顯子21 為主，云南和廣東地區以外顯子19 為主。云南宣威是肺癌高發的地區，其EGFR基因外顯子18 G719X、外顯子20 S768I突變相對較高。

本研究檢測云南地區37例NSCLC 患者血漿EGFR基因，結果發現EGFR基因突變陽性14例，突變率37.8%，同文獻報道相符。本研究結果顯示，云南地區NSCLC 患者中，EGFR 基因的突變主要發生在21 號外顯子L858R 突變及19 號外顯子缺失，與文獻報道一致。本研究中20號外顯子S761I無獨立突變，與18外顯子G719X伴隨存在，突變率為14.3%，這與楊長紹等人報道的云南宣威地區非小細胞肺癌組織標本中EGFR基因突變結果一致，原因是因為本研究選取的云南地區標本包括了云南宣威地區，只是由于標本量相對較少，進行區域劃分意義不大。Jian 等對56 例晚期NSCLC 患者血樣本檢測EGFR突變的檢出率為23.2%，并認為血中檢測到的EGFR突變可以用于預測吉非替尼的治療療效。Liu等對比了不同方法檢測血漿樣本與組織樣本EGFR 突變的準確性，發現與組織樣本相比，血漿的靈敏度67.5%（ 27/40），特異性為100%（ 46/46）。Kim 等對57 例配對樣品的組織和血漿分別進行EGFR突變檢測，血漿樣本和組織樣本EGFR突變狀態的一致率87.7%。

綜上所述，應用ARMS方法檢測外周血中腫瘤細胞的EGFR基因突變，可以較準確地反映NSCLC患者的EGFR突變情況，而且耗時短，損傷小，標本易得且經濟實惠，是值得臨床推廣。但由于ctDNA的含量非常少，通過外周血檢測EGFR突變仍有一定的局限性。雖然一次檢測外周血EGFR突變陰性，但不說明實體腫瘤細胞的EGFR突變也是陰性，多次檢測中任何一次突變陽性都可以成為臨床使用EGFR-TKI的依據。但由于外周血樣本存在假陰性的可能，組織標本存在腫瘤異質性等特點，因此，我們建議在送檢時應進行多種標本兼顧。

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