桑樹NBS．LRR類基因家族的全基因組鑒定及其調控microRNAs分析

劉潮 褚洪龍 韓利紅 楊云錦 高永 唐利洲

摘要：利用生物信息學方法，全面分析了桑樹NBS-LRR類基因家族組成、結構、進化、組織表達，并對該家族基因的調控microRNA（ miRNA）進行了預測。共篩選到112個桑樹NBS-LRR類基因，根據功能域主要分為NBS、CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR 4種類型。內含子數和相位分析結果顯示，基因結構類型多樣。聚類分析結果顯示不同聚類組間存在較多的類型交叉現象。該家族基因存在組織表達特異性。大部分桑樹NBS-LRR類基因均具有被miRNAs調控的可能性，miR472b和miR482b在調控該家族基因表達中可能發揮了主要作用。桑樹NBS-LRR家族基因結構和進化的復雜性決定了其功能的多樣性，miRNA在控制該家族基因表達的適應性成本中發揮作用。

關鍵詞： 桑樹;NBS-LRR;生物信息學;miRNA

中圖分類號： S792.99

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0544-10

植物在與病原的長期協同進化過程中，發展出了一整套高度復雜的免疫系統，以識別并對抗病原的侵襲。植物先天免疫系統包括2層防御系統：第1層是植物通過細胞表面的模式識別受體（ Patternrecognition receptors，PRRs）對保守的病原/微生物相關分子模式（ Pathogen/microbe associated molecularpattern，P/MAMP）的識別，稱為病原相關分子模式引發的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）[1-3];第2層的免疫一般發生在細胞內部，主要依靠抗性基因（ Re-sistance gene）編碼的多態性抗病蛋白識別無毒因子而實現，這些蛋白質多數是胞內富含亮氨酸重復序列和核苷酸結合位點蛋白（ Nucleotide binding site andleucine-rich repeat proteins， NBS-LRR proteins），能直接或間接識別病原特異性效應蛋白，而激發相似的防御反應，稱為效應子引發的免疫（Effector-triggeredimmunity，ETI）[1]。與PRRs相比，R蛋白在進化上出現相對較晚，在與病原互作中持續出現了大量新成員。典型的NBS-LRR類基因編碼的蛋白質具有一些共同的結構域：位于中心區的NBS結構域、C端的LRR結構域、N端與Toll/白細胞介素受體（Toll-inter-leukin-l receptor，TIR）同源的結構域或卷曲螺旋（ Coiled coil，CC）結構域。其中中心區的NBS作為一個信號轉換器，通過與ADP或ATP的結合而改變蛋白質的鈍化或激活狀態，使信號關閉或開放;C端的LRR結構域是植物R蛋白中最具多態性的部分，與其識別效應子的特異性相關[4];N端的CC或TIR結構域則在下游信號的激活中發揮關鍵作用[5-6]。NB-ARC結構域是在細菌和真核生物中發現的信號基序，存在于植物抗病基因和動物細胞凋亡調節基因中[7]，這一結構域無論是在植物還是動物的NBS-LRR蛋白中都十分保守[4]，并成為克隆各種作物抗病基因類似物（ Resistance gene analogs，RGAs）的NBS區域重要的序列依據。

有研究結果表明，小RNA在植物的先天免疫中發揮作用[8]。植物抗病基因存在適應性成本，NBS-LRR的高表達對植物的生長是不利的[9]。MicroRNA是一類21 nt的小分子RNA.miRNA通過轉錄或轉錄后水平調控NBS-LRR類基因的表達[1O-11]。在進化上，NBS-LRR類基因與其調控的miRNA在基因組水平上保持動態平衡，從而控制了NBS-LRR的潛在適應性成本[12]。同一家族miRNA往往有靶向保守區域，因此一個miRNA可靶向多個NBS-LRR類基因[13-14]。

川桑（Morus notabilis）是桑科桑屬落葉喬木，分布于中國中部和北部各省。桑葉養蠶在中國有著悠久的歷史，是中國絲綢文化的基礎。桑樹木材可用于制作器具，樹皮可作為造紙原料，桑椹可供食用、釀酒。田間栽培中，經常出現桑萎縮病、疫病、褐斑病、赤銹病和青枯病等多種病害，往往造成植株發育不良、桑葉產量降低和品質變劣等問題，嚴重影響蠶桑產業的健康發展。目前，隨著川桑基因組數據的公布[15]，大量桑樹抗病基因的研究結果先后發表[16-19]，然而關于桑樹NBS-LRR家族基因的研究鮮見報道。本研究利用生物信息學方法對桑樹基因組中NBS-LRR類基因進行鑒定，并分析該家族基因結構、系統發育、組織表達及其調控miRNA特征，為NBS-LRR類基因功能的揭示和開發利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 桑樹NBS-LRR類基因的獲取

以擬南芥NBS-LRR類基因序列為查詢序列，搜索桑樹基因組數據庫（ https：//morus. swu. edu. cn/morusdb/），下載桑樹NBS-LRR類基因序列。

1.2 桑樹NBS-LRR類基因的鑒定與分類

通過GenBank數據庫在線工具CDD（ https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）鑒定蛋白質結構域。使用Pfam（ http：//pfam. xfam. org/）和COILS Server（http：//www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html）對候選NBS-LRR類基因編碼蛋白質結構域進行確認，包括NBS、TIR、LRR、CC等，排除不含NBS結構域的基因。根據蛋白質結構域類型，將NBS-LRR類基因進行分類。

1.3 桑樹NBS-LRR類基因和編碼蛋白質結構分析

所有桑樹NBS-LRR類基因堿基序列和編碼的氨基酸序列均從桑樹基因組數據庫下載。使用GSDS在線軟件（ http：//gsds. cbi. pku. edu. cn/index. php）繪制基因結構示意圖。通過MEME SUITE在線工具（ht-tp：//meme-suite. org/tools/meme）預測桑樹NBS-LRR蛋白質氨基酸序列的保守Motif，參數為默認設置。

1.4 桑樹NBS-LRR蛋白氨基酸序列比對與系統發育分析

對所有蛋白質使用ClustalX進行氨基酸序列比對。應用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹。

1.5 桑樹NBS-LRR類基因表達分析

通過桑樹基因組數據庫下載獲得候選NBS-LRR類基因轉錄組數據，分別對其在根、樹皮、冬芽、雄花和葉中表達進行分析。

1.6 miRNA靶標NBS-LRR類基因預測

根據序列互補原則對NBS-LRR類基因的調控miRNA進行預測。使用psRNATarget在線軟件（ht-tp：//plantgrn. noble. org/psRNATarget/）對文獻中111個桑樹miRNA[ 20-21]的靶標NBS-LRR類基因進行預測。

2 結果與分析

2.1 桑樹NBS-LRR類基因的鑒定與分類

通過搜索桑樹基因組數據庫，共獲得含有NBS核心結構的桑樹NBS-LRR類候選基因112個，占桑樹基因組總基因數（29 261個）的0.4%，其中編碼的蛋白質具有NBS、LRR和CC完整結構域的基因共33個，占NBS-LRR類基因的29.5%（表1）。編碼的蛋白質含有LRR結構域的有63個，不含LRR結構域的基因有49個。桑樹NBS-LRR類基因比例與擬南芥比較接近，而明顯少于其他一些物種[12];物種間NBS-IRR類基因數量存在較大差異，這可能與植物在進化過程中NBS-IRR類基因經受的選擇壓力有關。

研究發現，桑樹NBS-LRR類基因主要分為NBS、CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR4種結構類型。除了具有NBS、TIR、LRR、CC結構域之外，還包含DUF、P-loop、zf-RVT和RPW8等結構域類型。發現L848_014445、L848_013225、L848_013226含有RPW8結構域，RPW8為擬南芥白粉病廣譜抗性蛋白家族功能域，這些基因可能與植物的白粉病抗性有關。功能注釋分析結果顯示，編碼抗病蛋白RPM1基因34個，編碼抗病蛋白RGA基因24個，編碼抗病蛋白RPP13基因12個，此外還有非活性疾病易感蛋白LOVI、晚疫抗性蛋白、TMV抗性蛋白N等。

2.2 桑樹NBS-LRR類基因結構與系統發育分析

利用基因結構顯示系統對桑樹NBS-LRR類基因結構進行分析，發現該家族基因結構類型多樣。大部分CC-NBS-LRR類型基因只含有1個外顯子，編碼序列長度一致性較高，而NBS類型基因內含子數和內含子相位類型較復雜，編碼序列長度差異較大（圖1）。

使用MEME在線軟件對桑樹NBS-LRR蛋白質基序進行分析（表2）。Motif 1位于NBS功能域N末端，也是AAA功能域（ATPases associated witha variety of cellular activities）的一部分，參與膜融合、蛋白質水解和DNA復制等多種細胞過程;Motif 2- Motif 5和Motif 10位于NBS功能域中間部分，也是AAA功能域的組成部分;Motif 7位于NBS功能域的C端，大部分桑樹NBS-LRR蛋白均含有這些Motif，也有少部分桑樹缺少該類Moti;Motif 6位于LRR功能域內，也是SCOP dlfqva2功能域的一部分，屬于RNI-like超家族，由相似重復構成的規則結構，形成右手盧-a超螺旋的LRR功能域，NBS-LRR蛋白質中含有O至多個Motif 6，最多的IA84_025528蛋白質含有8個;Motif 8和Motif 9分別位于CC結構的N端和中部，在下游信號的激活中發揮作用，CC-NBS和CC-NBS-LRR類蛋白質含有至少1個該類Motif。

去掉部分相似度較低的序列，選擇92個桑樹NBS-LRR類基因構建NJ系統進化樹，對基因進化關系進行分析。結果（圖2）顯示，桑樹NBS-LRR類基因主要分為4個大的聚類組，4種主要NBS-LRR類基因聚類存在交叉現象，部分CC-NBS和NBS-LRR類基因聚類到CC-NBS-LRR組中，部分CC-NBS-LRR和NBS類基因聚到CC-NBS組中，部分NBS、CC-NBS-LRR和CC-NBS類基因聚到NBS-LRR組中，NBS組中含有多個其他3種基因類型成員。說明進化過程中不同類型的NBS-LRR類基因間可能存在遺傳信息的交換或共進化現象。每個小聚類組中，NBS類型基因的進化枝長要短于同組其他類型基因，表明該組基因可能來源于該NBS類型基因。

2.3 桑樹NBS-LRR類基因的組織表達

為了解桑樹NBS-LRR類基因的組織表達特征，下載并分析了桑樹基因組數據庫中轉錄組數據。共檢測到93個基因在不同組織中有表達（圖3）。其中基因L484_013225和L484_ 014445在所有檢測組織中均有較高表達，這2個基因均含有RPW8結構域，屬于RPW8-NBS-LRR結構域類型，可能在桑樹基礎抗病中發揮主要作用。L484一022383、L484一013226、L484_017039、LA84_ 025528、LA84一018436、LA84_017010、LA84一010201等基因在樹枝樹皮、雄花和葉中表達量較高，而在根（除L484一022383和LA84_ 013226外）和冬芽中表達量稍低。基因L484一013672僅在根和樹枝樹皮中檢測到較高表達。部分基因僅在特定組織中檢測到較低表達。總體而言，較多的NBS-LRR類基因在樹枝樹皮、雄花和葉等組織中表達值較高，其次是根，而冬芽中多數NBS-LRR類基因的表達較低或未檢測到表達。說明不同的NBS-LRR類基因在桑樹的不同組織中發揮作用，部分基因存在組織表達特異性。

2.4 miRNA對NBS-LRR類基因的調控分析

根據序列互補原則，利用psRNATarget在線軟件對桑樹miRNA與NBS-LRR類基因的調控關系進行序列比對分析，篩選到614個miRNA與NBS-LRR類基因存在調控關系，發現101個桑樹miRNA可調控106個NBS-LRR類基因。較低的期望值表示miRNA與靶基因序列匹配較好。非配對靶標位點最大能量（ UPE）為解開靶基因mRNA靶位點二級結構所需的能量，較低的UPE值表示miRNA結合或裂解靶基因的可能性較高。本研究選擇期望值小于3的部分比對結果進行展示（表3）。miR472b和miR482b可對多個NBS-LRR類基因靶標位點進行結合，LA84一022259同時被miR472b和miR482a-3p

2個miRNA識別。miRNA對靶標NBS-LRR類基因的調控有轉錄抑制和序列裂解2種方式，這2種抑制基因表達的方式比例相當，但不同類型miRNA的調控方式不同，miR472b可通過轉錄抑制和裂解2種方式調控不同靶基因的表達，miR482主要通過轉錄抑制方式調控靶基因表達（表3）。

3 討論

植物NBS-LRRS存在群體水平上的多態性，其在直系同源基因的序列組成和旁系同源基因的總體數量上都有差異，宿主中NBS-LRRS基因的數量與物種病原效應子的多態性有關[22]。自1994年第一個NBS-LRR類基因被成功克隆后[23]，大量NBS-LRR類基因陸續被研究和報道，研究集中在NBS-LRR類基因的多樣性及進化上[24]。本研究通過搜索桑樹基因組數據庫，共獲得112個具有NBS核心結構域的桑樹NBS-LRR類候選基因，其中63個同時具有NBS和LRR功能域。NBS結構域參與信號轉導，具有高度保守和序列一致的基序，而LRR結構域參與病原體配體的識別，通常是高度可變的[25]。進化分析結果顯示，桑樹NBS-LRR類基因聚類存在類型間的交叉，成員較少的聚類組中基因類型一致性較高，而成員較多的聚類組中往往有多個類型的基因。聚類組中類型和結構一致的基因可能是由共同的NBS-LRR類祖先基因復制而來，而同一聚類組中不同類型的基因可能是由異位重組而來，異位重組導致該聚類組基因的擴張[24]。有些抗病基因需要2個NBS-LRR類基因共同介導，例如水稻中Pikml TS和Pikm2 TS共同介導抗病基因Pikm[26] ，RRS1和RPS4在十字花科植物多種細菌性病害抗性中共同發揮作用[27]。這可能與NBS-LRR類基因的適應性成本有關，也是該家族基因進化復雜性的體現。

多個NBS-LRR類基因被鑒定為廣譜抗性基因，過表達NBS-LRR類基因，顯著增強了植物的抗病性[28]。本研究中，NBS-LRR類基因的組織表達存在差異，基因L484一013225和IA84一014445在多個組織中均有較高表達，這2個基因編碼的蛋白質均含有白粉病抗性蛋白功能域RPW8，可能在桑樹的基礎抗病中起作用，而L484一022383等基因在部分組織中表達較高，可能在桑樹的特定組織器官或特定時期生長發育或抗病中發揮作用，也有些基因組織表達水平較低或未檢測到表達，這些基因可能參與植物特定時期的抗病過程或者處于非激活狀態。

miRNA作為調節子在NBS-LRR類基因的表達調控中發揮作用[24]。植物NBS-LRR類基因的高表達導致能量損耗而影響植物生長，植物進化出miR-NA-NBS-LRR系統來調控NBS-LRR的表達[12]。Lu等[29]首次報道了miRNA對NBS-LRR類基因的調控，隨后大量miNRA與其靶NBS-LRR類基因的作用關系被明確[8]。番茄miR482通過靶NBS-IRR受體的P-loop，與168個抗性基因中的58個發生作用30]。在番茄、馬鈴薯和煙草中至少搜索到10個miRNA家族及其靶抗性基因之間的作用關系，說明miRNA調節抗性基因表達在植物基因組中普遍存在[31]。通過對桑樹miRNA與NBS-LRR類基因調控關系的分析，發現大部分桑樹NBS-LRR類基因均具有被miRNA調控的潛在可能，有17個miRNA與靶標序列匹配期望值小于3，其中miR472b和miR482b均有5個靶NBS-LRR預測結合位點，這些miRNA在桑樹生長發育和抗病中的調控作用值得進一步深入研究。

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