引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP快速檢測方法的建立

王芝涵 王春偉 高海馨 荊琦 余廷濠 王燕

摘要：針對引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌（ Fusarium graminearum），根據翻譯延伸因子基因（EF-1alpha）的保守區域設計特異性引物，通過優化反應時間和溫度，建立一種靈敏、快速的環介導等溫擴增（ LAMP）檢測方法，并對優化的F graminearum LAMP反應體系進行特異性、靈敏度及可行性檢測。結果表明，該LAMP方法能夠有效檢測禾谷鐮刀菌的基因組DNA，64℃、45 min為最優反應條件。在最佳條件下，該方法對禾谷鐮刀菌具有良好的特異性，檢測靈敏度可達到100 pg/μl。該檢測方法為禾谷鐮刀菌引起的玉米穗腐病的田間快速診斷及病原菌監測奠定了基礎。

關鍵詞：禾谷鐮刀菌;翻譯延伸因子基因;環介導等溫擴增;分子檢測

中圖分類號：S432.4+4

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0581-05玉米穗腐病是玉米最常見的病害之一，在中國玉米種植區普遍發生，發病率為5% - 10%，感病品種的發病率高達50%，個別地塊嚴重時可達100% [1-2]，造成了巨大的損失。玉米穗腐病由多種病原菌侵染所致，鐮刀菌為主要病原菌[3]，而且鐮刀菌在致病過程中能產生多種毒素（如赤霉烯酮、單端孢霉毒素、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等），可促使細胞凋亡，對動植物機體造成多種病理損傷，給人類的食物安全帶來嚴重隱患[4]。目前，已報道的引起玉米穗腐病的鐮刀菌有15種以上[5]，其中禾谷鐮刀菌[6-7]為優勢種群。鐮刀菌形態具有多型性和變異性，僅依據形態特征進行病原菌的準確鑒定具有較大難度[8]，并且傳統鑒定方法存在檢測周期長、工作量大、結果不準確等問題[9]。因此，及時、有效地對鐮刀菌進行快速、準確檢測，是防止其寄主植物病害發生，保證農產品質量安全的基礎。

目前，對病原菌的傳統檢測方法有形態學鑒定、酶聯免疫吸附試驗（ ELISA）、聚合酶鏈反應（PCR）等[10-11]，這些方法不僅操作繁雜、費時、準確度低，還易遺漏潛育期或隱癥的病原菌，導致病害暴發。傳統病原學檢測方法已不能滿足現代植物病理學研究的需要，建立一種快速、靈敏、準確的檢測方法對玉米穗腐病的防控具有重要意義。環介導等溫擴增（LAMP）是日本學者Notomi在傳統PCR技術基礎上發展起來的一種新型體外核酸擴增方法[12]，隨著IAMP的優點逐漸為研究者所熟知[13-16]，將該技術應用于檢測各種病原體的同時，研究者們也對該技術提出了很多改進建議，使得該技術逐步完善，現已廣泛應用于細菌或病毒的定性定量檢測、臨床疾病診斷以及動植物中致病微生物檢測等相關領域[17]。

本研究擬利用LAMP技術，針對翻譯延伸因子基因（EF-1alpha]的保守區域設計特異性引物，建立禾谷鐮刀菌的IAMP快速分子檢測體系，以期為玉米穗腐病的病原監測及病害防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016年采集到玉米穗腐病樣品，從中分離獲得禾谷鐮刀菌（Fusarium gramznearum），以及實驗室保存的層出鐮刀菌（F.proliferatum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、輪枝鐮刀菌（F.verticillioide）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）、磚紅鐮刀菌（F.lateritium）、燕麥鐮刀菌（P avenaceum）、變紅鐮刀菌（F incar-natum）、藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、灰葡萄孢（Botrytisci一nerea）、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）。以上菌株均保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂糖培養基（PDA）試管斜面，置于4℃冰箱中。

1.2 試劑及儀器

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，6×Loading buffer，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，LAMP PCR Master Mix反應液、10×Tris-Tricncme緩沖液、4S Green核酸染色劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

SANYO超凈工作臺、Eppendorf PCR儀、Eppendorf超低溫高速離心機、制冰機、電泳儀、Nanodr0 2000微量分光光度計、BIO-RAD凝膠成像系統、Thermo超純水儀、紫外分光光度計、OLYMPUSDP72光學數字顯微鏡、SANYO超低溫菌種保存柜和人工氣候箱由植物病理學山西省重點實驗室提供。

1.3 LAMP引物篩選

通過測定禾谷鐮刀菌（F graminearum）的EF-lalpha保守區域堿基序列，使用Clustal X軟件對鐮刀屬及其他病原菌不同種間EF-1alpha基因堿基序列進行比對分析。利用Primer Explorer V5軟件設計出一套引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP檢測引物組合，由1對外側引物（ F3/B3）、l對內側引物（ FIP/BIP）和1對環引物（Loop F/Loop B）組成。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用ddH，0溶解后分裝，保存于4℃冰箱中備用。引物序列如表1顯示。

1.4 DNA提取

采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取14種菌株的DNA。以ddH20作為空白對照。

1.5 LAMP體系優化

反應體系為25.0μl： 12.5μl 2x Lamp MasterMix，10.0 μmol/L內側引物FIP和BIP各2.0μl，10.0μmol/L外側引物F3和B3各0.5μl，10.0μmol/L環引物LoopB和Loop F各1.0μl，1.0μl TemplateDNA， 0.5μl DNA Polymerase， 4.0μl SterilizedddH20。將反應溶液混勻，放人恒溫水浴鍋，對反應溫度和反應時間進行優化，反應結束后觀察2%瓊脂糖凝膠電泳結果，每個試驗重復3次。

瓊脂糖凝膠電泳圖觀察：稱取0.7 9瓊脂糖，加35.0 ml TAE緩沖液，用微波爐加熱1.5 min后加入6.5μl染色劑。取5.0μl LAMP產物與6×Loadingbuffer混勻染色，在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，若有亮條帶出現，則表明擴增產物存在。

1.6 LAMP檢測方法的靈敏度

用DNA質量濃度測定儀測定玉米禾谷鐮刀菌DNA質量濃度。將DNA質量濃度依次稀釋，使得質量濃度梯度依次為10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl，分別取2.Oμl作為LAMP檢測方法的反應模板，每個質量濃度梯度設置3個重復。反應結束后觀察結果，確定LAMP檢測方法的靈敏度。

1.7 LAMP檢測方法的特異性

將上述14種供試菌株的基因組DNA進行IAMP擴增，反應結束后觀察IAMP反應的特異性結果。

選用健康的玉米籽粒，先在實驗室的無菌操作臺進行消毒處理，用2%的次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡2 min，無菌水沖洗、晾干。再用接種針在籽粒上刺約3 mmx2 mm（深×寬）的傷口，傷口晾干后接種禾谷鐮刀菌孢子懸浮液（1 ml lx10個孢子）10μl。籽粒晾干后用滅菌保鮮膜包裹，貯藏于20℃培養箱中，并保持95%左右的相對濕度。

采集田間發生玉米穗腐病的玉米籽粒和人工接種禾谷鐮刀菌發病的玉米籽粒，從每份樣品中挑取100 mg鮮組織，用NaOH快速裂解法提取DNA[18]，作為模板用于LAMP擴增，以上處理重復3次。以玉米穗腐病禾谷鐮刀菌純DNA作為陽性對照，以空白PDA平板接種健康玉米基因組DNA作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 反應溫度的優化

為了探索IAMP的最佳反應溫度，從61- 65℃進行LAMP檢測，反應時間60 min，反應結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取最清晰條帶所對應的反應溫度。結果（圖1）表明，61-65℃條件下均能進行擴增，反應溫度為64℃時條帶最清晰。

2.2 反應時間的優化

為了明確LAMP檢測方法的最佳反應時間，在64℃的反應溫度下，分別在15 min、30 min、45 min、60 min、75 min條件下進行環介導等溫擴增反應。結果（圖2）表明，反應時間為45 min時，便可觀察到清晰條帶，符合快速檢測的要求。

2.3 LAMP檢驗方法的靈敏度

對提取的禾谷鐮刀菌基因組DNA進行梯度稀釋，結果（圖3）顯示，質量濃度為100 pg/μI仍能看見清晰條帶，表明該體系檢測靈敏度高。

2.4 LAMP引物的特異性

對14種供試菌株進行LAMP擴增檢測，結果（圖4）表明，禾谷鐮刀菌在電泳后可觀察到明亮的條帶，而其他供試菌株電泳后未觀察到清晰的梯形條帶。說明，該體系對禾谷鐮刀菌具有很好的特異性。

2.5 發病組織的LAMP檢測

使用優化之后的LAMP反應體系，對禾谷鐮刀菌純DNA（陽性對照）、人工接種禾谷鐮刀菌發病籽粒DNA樣品、采集的田間發病籽粒DNA樣品、健康籽粒的DNA樣品和空白PDA平板接種的玉米基因組DNA（陰性對照）進行LAMP快速檢測。結果（圖5）表明，陽性對照、人工接種禾谷鐮刀菌發病籽粒DNA樣品、田間發病籽粒DNA樣品的2%瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰，而健康籽粒的DNA樣品和陰性對照未檢測到清晰條帶。

3 討論

在中國，玉米穗腐病病原菌的種類多[19]，其中禾谷鐮刀菌（F.graminearum）是引起玉米穗腐病的主要病原菌[3]，對玉米的危害較大。目前，PCR方法已經成功用于玉米穗腐病病原菌的檢測20-22]。史亞娟等20]建立了禾谷鐮刀菌和擬輪枝鐮孢菌的快速和定量檢測體系，劉金華等[21]應用PCR技術檢測玉米中的禾谷鐮刀菌，焦鑄錦等[22]建立鐮刀菌基因敲除體系，同源重組核酸片段的PCR轉化過程需要2-3 h。由于普通PCR反應耗時長，對操作人員、操作環境和儀器設備的要求高，因此，目前需要建立一種安全、準確、高效的檢測方法。

雙重PCR檢測體系中，DNA模板的檢測靈敏度為6. 25 ng/μl，低于傳統的PCR檢測標準，能夠滿足快速檢測的要求[20]。本研究基于玉米穗腐病禾谷鐮刀菌建立了IAMP快速檢測方法，靈敏度為100 P9/μl，但是由于IAMP的靈敏性較高，容易造成假陽性現象，因此需要對試驗器材進行定期消毒處理，并采用不同的移液器操作，以避免交叉感染。影響IAMP反應的因素很多，反應體系中的每個參數都可能會影響最終的結果。

引物是否具有特異性是決定IAMP檢測方法成敗的關鍵。現階段，用于鑒定和檢測禾谷鐮刀菌的靶標中，核糖體轉錄間隔區域基因（ITS）是最常用的靶標，但對于一些近似種，其ITS區域同源性相對較高，很難設計出特異性引物[23]。EF-1alpha基因的保守區域具有足夠多的特異性位點，并且其序列在種內相對保守，非常適合作為禾谷鐮刀菌的分子檢測靶標[24-25]。因此，本研究選擇EF-1alpha基因作為禾谷鐮刀菌特異性檢測的靶標基因。LAMP引物的設計和篩選有其獨特的原則及規律，利用Primer Explorer V5軟件，設計出一套引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP檢測引物組合。LAMP反應中內引物FIP/BIP和外引物F3/B3的特異性決定了反應的特異性。對供試菌株基因組DNA進行IAMP特異性分析，檢測結果顯示，LAMP體系只對禾谷鐮刀菌表現出良好的特異性。段亞冰等[26]通過人工接種禾谷鐮刀菌，檢測LAMP反應體系在小麥赤霉病對多菌靈抗藥性檢測應用中的可靠性。在本試驗中，為了提高LAMP檢測特異性的可靠性，對采集的田間發生玉米穗腐病的玉米籽粒樣品進行檢測，結果顯示出良好的特異性。

LAMP快速檢測方法具有普通PCR所不能比擬的優點，它操作簡便，檢出效率高，用時短，不需要復雜的儀器設備，更適合在基層推廣應用[27-28]。同時，可結合NaOH快速提取DNA技術，使玉米穗腐病檢測方法在田間應用成為可能。該體系為田間玉米穗腐病病原的快速檢測和病害防治工作奠定了基礎。

參考文獻：

[1]郭滿庫，王曉鳴，何蘇琴，等.2009年甘肅省玉米穗腐病、莖基腐病的發生危害[J].植物保護，2011.37（4）：134-137.

[2]陳捷，我國玉米穗、莖腐病病害研究現狀與展望[J].沈陽農業大學學報，2000， 31（5）：393-401.

[3]黃思良，盧維宏，陶愛麗，等.南陽市玉米穗腐病致病鐮刀菌種群結構分析[J].南陽師范學院學報，2012.11（3）：54-57.

[4] 張衛娜，賈諫，陸曉宇，等，鐮刀菌屬真菌毒素的研究進展[J].廣東農業科學，2013 ，40（15）：130-133.

[5]SARVER B A J，WARD T J，CALE L R，et aL Novel Fusariumhead blight pathogens from Nepal and Louisiana revealed bv multi-locus genealogical concordance[J].Fungal Cenetics and Biology，2011， 48（ 12）： 1096-1107.

[6]秦子惠，任旭，江凱，等.我國玉米穗腐病致病鐮孢種群及禾谷鐮孢復合種的鑒定[J].植物保護學報，2014， 41（5）： 589-596.

[7]LEE S H，LEE JK，NAMY J，et al-Population structure of Fu-sanum graminearum from maize and rice in 2009 in Korea[ J].The Plant Pathology Joumal， 2010 ，26（4）：321-327.

[8] LESLIE J F，ZELLER K A，SUMMERELL B A.Icebergs andspecies in populations of Fusarium [J].Physiologcal andMolecular Plant Pathology，2001， 59（3）：107-117.

[9]趙柏霞，高增貴，莊敬華，等，瓜類保護地土壤鐮孢菌種群及UP-PCR多樣性分析[J].應用生態學報，2009， 20（4）：857-862.

[10] ALBERT H H，SCHENCK S. PCR amplification from a homolog ofthe BE mating-type gene as a sensitive assay for the presence ofUstilago scitaminea DNA[J].Plant Disease，1996 ，80（ 10）：1189.

[11] SHEN W， XI P，LI M， et al-Development of a sensitive nested-polymerase chain reaction（ PCR） assay for the detection of Ustilagoscitaminea[J].African Journal of Biotechnology， 2012， 11（ 46）：10541-10547.

[12] NOTOMI T，OKAYAMA H，MASUBUCHI H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Re-search，2000， 28（ 12）： 63-69.

[13] FUKUTA S， KATOS， YOSHIDA K，et al. Detection of tomato vellowleaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction[J]Joumal of Virological Methods， 2003， 112（ 1/2）： 35-40.

[14] IWAMOTO T，SONOBE T，HAYASHI K.Loop-mediated isother-mal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosiscomplex，Mavium， andMintracellulare in sputum samples[J"Joumal of Clinical Microbiology， 2003， 41（6）：2616-2622.

[15] KUBOKI N， INOUE N， SAKURAI T，et al-Loop-mediated iso-thermal amplification for detection of African trypanosomes[J].Joumal of Clinical Microbiology， 2003， 41（ 12）： 5517-5524.

[16] ENDO S，KOMORIT，RICCIG，et al- Detection of gp43 0f Para-coccidioides brasiliensis bv the loop-mediated isothermalamplification（ LAMP） method[J].FEMS Microbiology Letters，2004.234（1）：93-97.

[17] HUANG J L，WU J Z，LI C J，et al-Detection of Phytophthoranicotianae in soil with real-time quantitative PCR[J].Journal ofPhytopathology， 2010， 158（1）：15-21.

[18]吳向遠，丁冬，宋桂良，等，玉米載因組DNA快速提取方法[J].河南農業大學學報，2012，46（1）：7-10.

[19] ZHANG T，SUN X D. LYU G Z.Fusarium species and itsisolation frequency from rot ears of maize in Northeast China[J].Joumal of Fungal Research， 2011，9（1）：9-14.

[20]史亞娟，孫新艷，袁虹霞，等，引起玉米穗腐病的兩種鐮孢菌雙重PCR快速檢測體系的建立[J].植物病理學報，2017，47 （1）：35-39.

[21]劉金華，肖成蕊，魏春艷，應用PCR技術檢測玉米中的禾谷鐮刀菌[J].植物檢疫，2004，18（6）：333-335.

[22]焦鑄錦，黃思良.玉米穗腐病致病層出鐮刀菌基因敲除體系的構建[C]//中國植物病理學會，中國植物病理學會2014年學術年會論文集，北京：中國農業科學技術出版社，2014.

[23] BRASIER C，KIRK S，DELCAN J，et a1.Phytophthora alni sp.nov.and its variants： designation of emerging heteroploid hybridpathogens spreading on Alnus trees[J].Mycological Research，2004， 108（ 10）：1172-1184.

[24]姚正穎，張丹，李春霞，等.能源植物續隨子延伸因子EFIA基因cDNA序列的克隆及分析[J].中國野生植物資源，2016，35（1）：6-11，27.

[25]覃迎姿，黃先益，葉興枝，等，植物延伸因子eEFIA研究進展[J].廣西農業科學，2009 ，40（5）：472-477.

[26]段亞冰，效雪梅，楊瑩，等，一種基于LAMP技術快速檢測小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性方法的建立及應用[J].南京農業大學學報，2016，39（1）：97-105.

[27]賈蒙驁，陳興江，林葉春，等.基于環式等溫擴增的煙草青枯病病原菌快速檢測方法[J].中國農業大學學報，2014， 19（1）： 93-98.

[28]李本金，劉裴清，劉小麗，等.荔枝霜疫霉巢式PCR和IAMP檢測方法的建立[J].農業生物技術學報，2016，24（6）：919-927.

（責任編輯：王妮）