不同發酵時期大麥青貯品質和微生物多樣性變化

劉蓓一 宦海琳 顧洪如 許能祥 沈琴 丁成龍

摘要：本試驗旨在闡明不同發酵時期大麥青貯發酵品質及細菌多樣性的動態變化。試驗分別在青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d和有氧暴露第Sd采樣，對青貯飼料的發酵品質、營養成分等進行測定，并采用Miseq高通量測序技術分析細菌的多樣性和組成。結果表明，與青貯第2d相比，大麥青貯第60 d的pH值顯著下降（P<0.05），乳酸含量顯著升高（P<0.05）。青貯第2 d的細菌優勢菌群是魏斯氏菌屬（Weissella）和乳桿菌屬（Lactobacil-lus），相對豐度分別為45. 960%、30. 680%。青貯第14 d的細菌優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus），相對豐度為74.720%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella），相對豐度為13.170%。青貯第60 d的細菌優勢菌群為乳桿菌屬（Lactoba-cillus），相對豐度為96.740%。有氧暴露第5d乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度為0.710%，有氧暴露后滋生了不動桿菌屬（Acinetobacter]、沙雷氏菌屬（Serratia）等有害菌。綜上所述，青貯第2-60 d大麥青貯的優勢菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后菌群結構發生了變化，不動桿菌屬、沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度增加。

關鍵詞：青貯品質;大麥青貯;Miseq高通量測序;細菌菌群

中圖分類號： S512.3

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2019）03-0653-08

大麥是主要的谷類作物之一，因具有抗逆性強、適應性廣等特點而被廣泛種植。大麥是重要的糧飼兼用作物之一，其籽粒是畜禽的精飼料，蛋白質含量顯著高于玉米，而淀粉含量比玉米略低。目前，草食家畜的優質粗飼料極度缺乏，豐富的水溶性碳水化合物和適宜的水含量是制作優質青貯飼料的基礎。大麥的水溶性碳水化合物含量較高，可以為乳酸鹽生產提供充足的底物，所以全株大麥適宜青貯，從而為革食家畜提供優質的冬季粗飼料[1]。

在開窖、取料和飼喂過程中，青貯飼料與外部空氣頻繁接觸，容易通過二次發酵導致有氧腐敗[2]。在二次發酵過程中，會產生大量腐敗菌，造成飼料營養成分喪失，進而影響動物生產性能[3]。田靜等[4]研究發現，大麥青貯過程中添加植物乳桿菌（Lacto-bacillus plantarum）可以顯著增加青貯飼料的乳酸含量，降低pH值，提高大麥青貯飼料的發酵品質，添加類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraqinis）ZH1可以提高大麥抽穗期和開花期青貯飼料的發酵品質，且有效提高其有氧穩定性。Kim等[5]指出，植物乳桿菌和丙酸都能減少酵母菌的數量，從而減少有氧腐敗。

青貯過程是一個復雜的微生物發酵體系，有多種微生物參與，且不同種類微生物對青貯飼料品質的影響不同[6]。因此，全面了解大麥青貯期間和有氧暴露后微生物菌群組成及主要有害菌種類，才能更好地防止有氧腐敗。目前，采用傳統可培養方法從青貯飼料中已分離鑒定出的微生物主要有乳酸菌、酵母菌、霉菌等[7-8]。但是傳統的微生物培養方法只能分離到約1%的環境微生物，無法真正完全了解微生物的組成，而且傳統培養法耗時長，操作復雜[9]。隨著分子生物學技術的發展，16S rRNA克隆建庫、變性梯度凝膠電泳技術（ PCR-DGGE）、限制性片段長度多樣性（T—RFLP）等非培養方法被廣泛應用于青貯飼料微生物多樣性的研究中[10-12]，但是這些技術鑒定到的優勢物種不夠全面[13]。采用高通量測序技術直接從樣品中提取DNA，能完整地分析樣品全貌并且最大限度地展示樣品中的微生物種類和豐度[14]，揭示青貯飼料中有益菌和有害菌的種類。Zheng等[15]利用高通量測序技術研究添加乳酸菌和蔗糖對苜蓿青貯過程中微生物菌群的影響，發現添加乳酸菌和蔗糖可以阻止梭菌定殖，而未添加組的優勢菌群是產氣莢膜梭菌、硫酸鹽還原菌和巴氏梭菌。劉晶晶[16]用高通量測序技術研究不同乳酸菌添加劑對柳枝稷青貯微生物多樣性的影響，發現接種復合乳酸菌可以降低青貯飼料的細菌群落多樣性，有效抑制腸桿菌屬細菌的相對豐度，提高乳桿菌屬細菌的相對豐度。然而，高通量測序技術在青貯飼料方面應用的報道較少。

本試驗擬利用Miseq高通量測序技術與常規發酵品質分析相結合的方法，研究大麥青貯過程中不同發酵時期的青貯品質、營養成分及微生物多樣性，監測微生物菌群組成的動態變化，為添加劑的安全使用和發酵調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和樣品采集

2017年5月，在大豐區眾鑫農機服務專業合作社基地采集試驗樣品（全株大麥），切割為1-2 cm大小的青貯原料，通過微波干燥，計算其中的水分含量，在其水分含量為70%時開始青貯。裝入聚乙烯包裝袋內，每袋500g，用真空封口機（DZQ-400/2D，上?？嫡b機械有限公司產品）封口，封口后置于室溫下避光保存。分別在青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d采樣，樣品分別標記為D2、D14、D60，D2和D14各取3袋，而D60取6袋，其中3袋用作青貯第60 d樣品的分析，另外3袋青貯飼料開啟后，將其混勻后置入IL聚乙烯罐中，罐口用雙層紗布包裹，防止蒼蠅等污染和水分散失.空氣可自由進入罐中，置于室溫條件下保存，有氧暴露后第5 d（A5）進行取樣。取每袋的中間部位作為樣品，其中一部分凍存于50 ml的無菌離心管中，-80℃保存，主要進行后期微生物多樣性檢測;一部分裝入封口袋于-20 ℃條件下保存，進行發酵品質測定;另外一部分（約10 g）用于微生物（包括乳酸菌、酵母菌、好氧細菌）數量的計數。剩余青貯飼料用于營養成分的測定。

1.2 青貯樣品發酵品質及微生物數量的測定

分別于4個不同青貯階段取20 g大麥青貯樣品，加入180 ml蒸餾水充分混勻，通過搗碎機攪拌lmm，采用4層紗布和定性濾紙進行過濾，獲得浸出液，于-20℃冰箱中保存待測，測定pH值，以及乳酸、乙酸、丙酸和乙醇的含量。pH值用MettlerToledo型pH計測定，乳酸、乙酸、丙酸、乙醇采用安捷倫1260高效液相檢測系統測定，配備示差檢測器和Carbomix@ H-NP;色譜性，流動相為2.5 mmol/LH2S04，流速為0.5 ml/min，溫度為55℃。

取10g樣品，置于無菌三角瓶內，并注入無菌生理鹽水，共計90 ml，密封處理，搖床搖晃2h，速度為120 r/min。單層無菌紗布過濾，進行逐級稀釋，稀釋梯度的懸浮液于MRS（ De Man Rogosa Sharpe）培養基中，在37℃厭氧的環境中培養2d，計算乳酸菌數量。將懸浮液接種于葡萄糖麥芽浸膏培養基中，30℃培養ld，計算酵母菌數量。將懸浮液接種于牛肉膏瓊脂培養基中，于30 ℃下培養ld，計算好氧細菌數量。

將剩余部分的青貯飼料收集起來烘干稱質量，測定干物質的含量。55℃烘箱中干燥48 h至恒定質量，測定干物質含量，采用范氏洗滌纖維法測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.3 青貯飼料微生物高通量測序

1.3.1 微生物基因組DNA的提取取青貯飼料樣品10 g，注入90 ml無菌生理鹽水，密封，120 r/min搖床搖2h。單層紗布過濾雜質，12 000 g離心15mm收集細菌菌體，然后利用PowerSoil DNAIsolation Kit試劑盒提取青貯飼料菌群的總DNA。

1.3.2 細菌16S rDNA的擴增使用細菌16S rRNA基因V3 - V4區引物對獲得的DNA模板進行序列擴增。引物序列為F（5 '-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和R（5，-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT_3 7）.PCR反應體系為50μl，包括5.0μl的SxPCR buffer，4.0¨l的dNTPs，0.3¨l的FastPfu DNA polymerase，30 ng模板DNA，2.0μl正向引物F（10 μmol/L），2.0μl的反向引物R（ 10μmol/L），采用ddH70補充到50μ1。PCR程序為：95℃預變性10 min;95℃變性30 s，56oC退火30 s，72℃延伸40 s，反應循環數為25次，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 測序PCR產物的濃度及目的條帶采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在其濃度適宜和條帶準確的情況下，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行測序。

1.3.4 生物信息學和數據分析使用Cutadapt（ V1.9.1）軟件先對Reads進行低質量剪切，基于Barcode對其樣品數據進行拆分，同時去除引物序列和Bar-code，獲取原始數據，在此基礎上，與物種注釋數據庫比對，進行嵌合體序列檢測，使用UCHIME軟件剔除嵌合體，獲取有效數據。

通過Uparse軟件對有效數據進行聚類分析，以97%的一致性將其聚類成為操作分類單元（OTUs），采用高頻次出現的序列作為代表序列[17]。在此基礎上，對選出來的代表序列進行物種注釋，完成物種注釋后，采用Mothur方法將其與SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，從而可以得到分類學信息以及基于不同分類水平的菌群組成。利用QIIME軟件對OTU進行多樣性指數分析[18]。細菌16S rRNA基因V3 - V4區采用Sliva細菌數據庫進行比對。物種注釋和豐度分析基于RDP classifier算法在QIIME平臺軟件上進行，通常在其置信度水平為90%的條件下進行[19]。

1.4 統計分析

試驗獲取數據信息，采用統計軟件SPSS19.0進行數據處理，數據比較采用方差分析，多重比較采用Duncan's法進行。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時期大麥青貯品質和微生物數量的變化

表1顯示，大麥青貯第2d的pH最高，經過60 d的青貯發酵，pH值顯著下降（P<0.05），但有氧暴露第5 d，pH值顯著上升，達到6.02+0.18（ P

表2顯示，青貯第2d大麥干物質含量最高，顯著高于青貯第14 d和青貯第60 d（P

2.3 不同發酵時期大麥青貯細菌的多樣性分析計算菌群豐度的指數有Chao指數、Ace指數，其數值越大，表示菌群豐度越高。表3顯示，青貯第2d的細菌Chao指數和Ace指數最高，青貯第60 d時最低。有氧暴露第5d的細菌Chao指數和Ace指數均高于青貯第60 d。Shannon指數是用來計算菌群多樣性的指數，Shannon指數越大，菌群多樣性越高。青貯第2- 60 d，隨著青貯時間的延長，細菌Shannon指數降低，但是有氧暴露第5d的Shannon指數增加，說明青貯第60 d時細菌多樣性最低，有氧暴露會使細菌多樣性增加。

2.4 不同發酵時期大麥青貯細菌菌群的主成分分析

由細菌菌群的主成分分析（圖1）可知，青貯第2d與青貯第14 d細菌菌群的距離較為接近，表明二者在微生物組成上差異不大，青貯第60 d與青貯第2d、青貯第14 d的細菌菌群距離較遠，存在一定差異，有氧暴露第Sd與其他3個取樣時間的細菌菌群距離也較遠。

2.5 不同發酵時期大麥青貯細菌菌群的組成變化

2.5.1 基于門水平的細菌茵群結構分析 表4顯示，相對豐度大于1%的門有厚壁菌門（ Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（ Bacteroidetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）等。青貯第2d的主要優勢菌群為厚壁菌門、變形菌門和藍細菌門，相對豐度分別為81.443%、3.702%、7.420%，總相對豐度為92.565%。青貯第14 d的主要優勢菌群為厚壁菌門（ 95.103%），其次是藍細菌門（1.040%），變形菌門（0.877%），總相對豐度為97.020%。青貯第60 d的主要優勢菌群為厚壁菌門，相對豐度為99.500%。有氧暴露第5d的主要優勢菌群為厚壁菌門和變形菌門，相對豐度分別為34.278%和45.110%.其次是擬桿菌門（13.090%），總相對豐度為92. 482%。門水平上，在大麥青貯第2-60 d厚壁菌門（Firmicutes）細菌始終占優勢地位，隨著青貯時間的延長，厚壁菌門細菌相對豐度呈增長趨勢，但是與青貯第60 d相比，有氧暴露第5d的厚壁菌門細菌相對豐度下降，變形菌門和擬桿菌門細菌相對豐度增加。

2.5.2 基于屬水平的細菌茵群結構分析表4顯示了在屬水平上不同發酵時期大麥青貯細菌菌群結構的變化。青貯第2d的優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），其相對豐度分別為30. 6800-/0和45. 960%。青貯第14 d的優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus），相對豐度為74. 720%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（ Pediococcus），相對豐度分別為13. 170%和7. 210%。青貯第60 d優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacitlus），相對豐度為96. 740%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）.相對豐度分別為1. 400%和1.3600-/0。有氧暴露第Sd，乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度僅占0.710%，而不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、普羅維登斯菌屬（Providencia）、穩桿菌屬（Empedobacter）和沙雷氏菌屬（Serratia）的相對豐度分別為26.540%、33.220%、16.400%、13.090%、2.170%。

青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d乳桿菌屬的相對豐度分別是30. 680%、74.720%、96.740%，即隨著青貯時間的延長，乳桿菌屬相對豐度增加，于青貯第60 d達到了峰值。但是有氧暴露第5d乳桿菌屬的相對豐度僅有0.710%，被不動桿菌屬、腸球菌屬、普羅維登斯菌屬、穩桿菌屬所取代。說明，青貯第2-60 d大麥青貯的優勢菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后菌群結構發生了變化，不動桿菌屬、沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度增加。

3 討論

3.1 不同發酵時期大麥青貯的發酵參數和微生物數量變化

大麥是中國主要的青貯原料之一。本試驗在大麥青貯第2d、第14 d、第60 d取樣，發現青貯飼料感官品質良好，無霉變和黏手現象，有酒酸香味，無臭味。但是在有氧暴露第Sd時，感官品質變差，有霉變現象。pH作為評判青貯成功的重要指標，pH值小于4.0時，青貯飼料品質優等，pH值為4.1-4.3，青貯飼料品質良好，pH值為4.4-5.0，青貯飼料品質一般，pH值在5.0以上，青貯飼料品質劣等[20]。試驗中，青貯第60 d的pH值達3.94+0.01，屬于品質優等，而有氧暴露Sd時pH值達6.02+0.18，品質劣等，即有氧暴露導致大麥青貯的有氧腐敗，降低了青貯品質，這與萬學瑞等21]報道的結果一致。在有氧條件下，隨著暴露時間的增加，pH值相應增加，這主要是由好氧性微生物增殖導致的[22]。青貯過程較為復雜，乳酸菌是青貯發酵過程中關鍵的微生物[23]，乳酸菌能否迅速大量繁殖決定著青貯的成敗。青貯第2-60 d，隨著青貯時間的延長，乳酸菌數量呈現先增加后降低的趨勢，有氧暴露第5d的乳酸菌數量最低。有氧條件下，大麥青貯容易發生二次有氧發酵，導致內部的酵母菌和好氧細菌迅速增殖，抑制乳酸菌的生長，引起青貯飼料變質。有學者認為，酵母菌和霉菌是導致青貯二次發酵過程中營養損失的主要原因，這是因為酵母菌和霉菌等好氧微生物可以氧化青貯有機酸，從而引起青貯飼料的有氧變質[24]。本研究中，有氧暴露第5d，酵母菌和好氧細菌數量顯著高于青貯第14 d和第60 d。因此，為提高大麥青貯品質和有氧穩定性，大麥青貯時應使用能提高有氧穩定性的添加劑。

3.2 大麥青貯細菌多樣性的動態變化

青貯飼料為復雜的微生物體系，在整個青貯過程中，有多種微生物參與，主要有原料附著微生物、發酵微生物和腐敗變質微生物[25]，因此研究微生物的菌群結構十分重要。本研究通過MiSeq高通量測序發現，大麥青貯期絕對優勢菌門為厚壁菌門。Eikmeyer等[26]利用NGS高通量測序技術進行研究，發現厚壁菌門是優勢菌，在青貯第14 d和第58d厚壁菌門的相對豐度分別為86.000%、87.000%。厚壁菌門中包括產芽孢、非產芽孢和支原體菌群，且大部分具有降解纖維素、蛋白質、淀粉等大分子化合物的作用[27]。厚壁菌門和變形菌門是苜蓿青貯飼料中主要的優勢菌門[13]。本研究中，有氧暴露第5d的優勢菌群為厚壁菌門和變形菌門，相對豐度分別為34. 278%和45. 110%。變形菌門為細菌中最大的門，包括大腸桿菌、弧菌和螺桿菌等，另外歐文氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬等也屬于變形菌門[28]。本研究采用MiSeq高通量測序技術對不同發酵時期大麥青貯的細菌菌群結構進行分析，發現青貯第2d、第14 d、第60 d乳桿菌屬占絕對優勢，其相對豐度分別是30. 680%、74.720%、96.740%，即相對豐度隨著青貯時間的延長呈增加趨勢，在青貯第60 d達到峰值，這與胡宗福等[29]的研究結果一致。Ennahar等[30]發現，青貯飼料發酵初期主要的優勢菌群為片球菌，從植物原料到青貯飼料，糞鏈球菌和腸膜明串珠菌在開始階段發揮作用，隨后被乳桿菌、短乳桿菌和布氏乳桿菌等更耐酸的乳酸菌代替。乳桿菌屬是青貯穩定期的主要菌群[31]，為青貯飼料發酵品質的提升提供了菌群保障。本研究中，在青貯第2d，魏斯氏菌屬也是優勢菌群，相對豐度為45.960%，青貯第14 d時，相對豐度為13.170%，到青貯第60 d時，其相對豐度僅為1. 400%，說明在青貯初期，魏斯氏菌屬具有重要作用，在青貯后期其作用明顯減退，這與陶蓮等[32]的研究結果一致。

不動桿菌是一種需氧的非發酵細菌，廣泛存在于水體、土壤等外界環境中，而在青貯飼料中很少發現。通過試驗發現，有氧暴露第5d，大麥青貯中不動桿菌屬的相對豐度達到26.540%，此時pH值為6.02+0.18。青貯第14 d、第60 d青貯飼料中幾乎不含不動桿菌屬，這2個階段青貯飼料的pH值都在3.96以下，即青貯飼料的pH值低于3.96時，不利于不動桿菌屬生長，這與Li等[33]報道的結果一致。Liu等[34]指出，青貯飼料開袋后，玉米秸稈青貯飼料好氧細菌主要由香味類香味菌、不動桿菌、嗜麥寡養食單胞菌、嗜線蟲沙雷氏菌、短小芽孢桿菌和紡錘型賴氨酸芽孢桿菌組成，推測玉米秸稈青貯有氧變質可能是由這些好氧細菌引起的。本試驗研究發現，有氧暴露后好氧細菌數量增加，這與Liu等[35]提出的較多好氧細菌會引起青貯飼料中乳酸發酵不足，從而導致柱花草青貯飼料好氧變質的結果一致。沙雷氏菌屬（Serratia）是腸桿菌目的一個屬，存在于土壤、水、植物以及動物的青貯飼料中。Parvin等[36]利用變性梯度凝膠電泳技術進行研究，發現青貯原料中不存在沙雷氏菌，而青貯飼料中卻檢測到了沙雷氏菌。居泉沙雷氏菌就是青貯飼料中比較常見的1種腸道細菌，雖然是非致病性細菌，但屬于有害菌，因為在青貯發酵初期，這類細菌會與乳酸菌爭奪青貯飼料中的碳水化合物，從而降低青貯飼料品質。因此，有氧暴露改變了大麥青貯飼料菌群的菌屬結構，抑制了乳酸菌的生長，為好氧菌的繁殖提供了良好環境，從而增加了不動桿菌屬和沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度。

參考文獻：

[1] HARGREAVES A，HILL J，LEAVER J D.Effect of stage ofgrowth on the chemical composition， nutritive value andensilabilitv of whole-crop barley[J].Animal Feed Science andTechnology， 2009， 152（ 1/2）：50-61.

[2]張適，常杰，胡宗福，等.青貯飼料有害微生物及其抑制措施[J].動物營養學報，2017，29（ 12）：4308-4313.

[3] 呂文龍，刁其玉，閆貴龍，布氏乳桿菌對青玉米秸青貯發酵品質和有氧穩定性的影響[J].草業學報，2011， 20（3）：143-148.

[4] 田靜，謝昭良，劉家杏，等.冬閑田種植大麥不同生育期的營養價值和青貯品質[J].草業科學，2017 ，34（4）：753-760.

[5] KIM D H，AMANULLAH S M. LEE H J，et al-Effect ofmicrobial and chemical combo additives on nutritive value and fer-mentation characteristic of whole crop barley silage[J].Asian-Aus-tralasion Journal of Animal Science， 2015， 28（9）：1274-1280.

[6] 倪奎奎.全株水稻青貯飼料中微生物群落以及發酵品質分析[D].鄭州：鄭州大學，2016.

[7] 熊乙，趙燕梅，許慶方，等，五個地區玉米青貯菌群多樣性的研究[J].草業科學，2017， 235（5）：16-22.

[8] RASMUSSEN R R，RASMUSSEN P H，LARSEN T O，et al.hvitro cytotoxicity of fungi spoiling maize silage[J]. Food andChemical Toxicology， 2011， 49（1）：31-44.

[9]LIN C J，BOLSEN K K，BRENT B E，et al-Epiphytic lactic acidbacteria succession during the pre-ensiling and ensiling periods ofalfalfa and maize[J].Joumal of Applied Microbiology， 1992， 73 （5）：375-387.

[10] ROSSI F，DELLACLIO F. Quality of silages from Italian farms asattested by number and identity of microbial indicators[ J].Journal of Applied Microbiology， 2007， 103（5）：1707-1715.

[11] GRAF K，ULRICH A，IDLER C，et al-Bacterial community dy-namics during ensiling of perennial ryegrass at two compaction lev-els monitored bY terminal restriction fragmnent length polymorphism[J]. Journal of Applied Microbiology， 2016， 120（6）：1479-1491.

[12] WANC Y S，SHI W， HUANC LT，et al-The effect of lactic acidbacterial starter culture and chemical additives on wilted rice strawsilage[J].Animal Science Joumal， 2016， 87（4）：525-535.

[13] MCCARVEY J A， FRANCO R B， PALUMBO J D， et al.Bacterial population dynamics during the ensiling of Medicagosativa（ a]fa]fa） and subsequent exposure to air[J].Journal of Ap-plied Microbiology， 2013， 114（6）：1661-1670.

[14] ASMA Z，SYLVIE C， LAURENT C， et al-Microbial ecology ofthe rumen evaluated by 454 GS FLX pyrosequencing is affected bystarch and oil supplementation of diets[J].FEMS Microbiology E-cology， 2013， 83（2）：504-514.

[15] ZHENG M L，NIU D Z，JIANG D， et al.Dynamics of microbialcommunity during ensiling direct-cut alfalfa with and without LABinoculant and sugar[J].Journal of Applied Microbiology， 2017，122（6）：1456-1470.

[16]劉晶晶，生物添加劑對柳枝稷青貯的作用及機理研究[D].北京：中國農業大學，2015.

[17] EDGAR R C.UPARSE： hi～ly accurate OTU sequences from mi-crobial amplicon reads[J].Nature Methods， 2013， 10（ 10）：996-998.

[18] KEMP P F，ALLER J Y.Bacterial diversity in aquatic and otherenvironments： what 16S rDNA libraries can tejl us[J].FEMS Mi-crobiology Ecology， 2004， 47（2）： 161-177.

[19] WANG Q， GARRITY G M， TIEDIE J M. et al-Naive Bayesianclassifier for rapid assignment of rRNA sequences into the newbacterial taxonomy[J].Applied and Environmental Microbiology，2007， 73（ 16）： 5261-5267.

[20]楊云貴，張越利，杜欣，等.2種玉米青貯飼料青貯過程中主要微生物的變化規律研究[J].畜牧獸醫學報，2012， 43（3）： 397-403.

[21]萬學瑞，吳建平，雷趙民，等，優良抑菌活性乳酸菌對玉米青貯及有氧暴露期微生物數量和pH的影響[J].草業學報，2016， 25（ 4）：204-211.

[22]王保平，董曉燕，董寬虎，等.有機酸對全株玉米青貯有氧穩定性的影響[J]。草地學報，2013， 21（5）：991-997.

[23] STOKES M R.Effects of an enzyme mixture， an inoculant， andtheir interaction on silage fermentation and dairy production[J].Joumal of Dairy Science， 1992， 75（3）： 764-773.

[24] DRIEHUIS F，ELFERINK S 0. SPOELSTRA S F.Anaerobiclactic acid degradation during ensilage of whole crop maize inocu-lated with Lactobacillus buchneri inhibits yeast growth andimproves aerobic stability[J].Journal of Applied Microbiology，1999， 87（4）：583-594.

[25]MUCK R E.Recent advances in silage microbiology[J].Agricul-tural and Food Science， 2013， 22（1）：3-15.

[26] EIKMEYER F G，KOFINGER P，POSCHENEL A， et al- Metage-nome analvses reveal the influence of the inoculant Lactobacillusbuchneri CD034 0n the microbial communitv involved in grass en-siling[J].Journal of Biotechnology， 2013， 167（3）：334-343.

[27]ROMERO J J，ZHAO Y， BALSECA-PAREDES M A. et al. Labo-ratory silo type and inoculation effects on nutritional composition，fermentation， and bacterial and fungal communities of oat silage[J]. Journal of Dairv Science， 2017， 100（3）：1812-1828.

[28] PENG K， JIN L，NIU Y D， et al.Condensed tannins affect bacte-rial and fungal microbiomes and mycotoxin production during ensi-ling and upon aerobic exposure[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology， 2018， 84（5）： 1-20.

[29]胡宗福，常杰，薩仁呼，等，基于宏基因組學技術檢測全株玉米青貯期間和暴露空氣后的微生物多樣性[J].動物營養學報，2017， 29（10）：3750-3760.

[30]ENNAHAR S， CAI Y M， FUJITA Y. Phylogenetic diversity of lac-tic acid bactena associated with paddy rice silage as determined by16S ribosomal DNA analysis[J].Applied and Environmental Mi-crobiology， 2003， 69（1）：444-451.

[31]陶雅，李峰，高鳳芹，等，籽粒莧與青貯玉米混貯品質及微生物特性研究[J].草業學報，2016，25（ 12）：119-129.

[32]陶蓮，刁其玉，青貯發酵對玉米秸稈品質及菌群構成的影響[J] .動物營養學報， 2016 . 28（ 1） ： 198-207.

[33] LI Y， NISHINO N. Effects of inoculation of Lactobacillusthamnosus and Lactobacillus buchneri on fermentation ， aerobic sta-bility and microbial communities in whole crop corn silage [J] .Grassland Science ， 2011 ， 57（ 4） ： 184-191.

[34] LIU Q H， SHAO T， ZHANG J G. Determination of aerobic deteri-oration of corn stalk silage caused by aerobic bacteria [ J] . AnimalFeed Science and Technology， 2013， 183（ 3/4） ： 124-131.

[35] LIU Q， ZHANC J， SHI S， et al. The effects of wilting and storagetemperatures on the fermentation quality and aerobic stability ofstylo silage [ J] .Animal Science Joumal， 2011 ， 82（ 4） ： 549-553.

[36] PARVIN S. WANG C， LI Y. et al. Effects of inoculation with lac-tic acid bacteria on the bacterial communities of Italian ryegrass，whole crop maize ， guinea grass and thodes grass silages[ J] . Ani-mal Feed Science and Technology， 2010， 160 （ 3/4 ） ： 160-166.