水稻OsTZF3基因敲除和過量表達載體的構建與遺傳轉化

周淑芬 劉華清

摘?要：為進一步研究水稻OsTZF3基因的生物學功能，利用日本晴基因組的OsTZF3基因序列，構建了OsTZF3的CRISP/Cas9敲除表達載體pKTZF3和過量表達載體pCXUNTZF3;并通過農桿菌介導法導入粳稻日本晴胚性愈傷組織中，分別獲得了pKTZF3和pCXUNTZF3轉化再生植株55個和42個克隆;進一步通過PCR法鑒定了35個克隆轉pKTZF3植株和10個克隆轉pCXUNTZF3植株。

關鍵詞：水稻;基因敲除;過量表達;遺傳轉化;OsTZF3

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.001

Abstract：In order to further study the biological function of OsTZF3 gene in rice， the CRISP/Cas9 knockout expression vector pKTZF3 and overexpression vector pCXUNTZF3 of OsTZF3 were constructed by using the sequence of OsTZF3 gene in Nipponbare. 55 transformants of pKTZF3 and 42 clones of pCXUNTZF3 were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Among them， 35 clones of pKTZF3 and 10 clones of pCXUNTZF3 were further identified by PCR detection.

Key words：Rice; Gene knockout; Overexpression; Transformation; OsTZF3

CCCH蛋白是一類特殊的鋅指蛋白，具有DNA和RNA結合的特性，在植物不同組織、發育階段及環境脅迫中具有多種功能。串聯鋅指（tandem zinc finger， TZF）基因是CCCH型鋅指蛋白基因的一個亞家族，其編碼蛋白包含一個保守的TZF模體，參與了多種細胞過程。進化上最保守的TZF模體是由中間隔18個氨基酸的2個相同CX8CX5CX3H結構域組成[1-2]。在植物還含有一類特殊的TZF模體，其結構特征為CX7-8CX5CX3HX16CX5CX4CX3H，即由中間間隔16個氨基酸的2個不同CX8CX5CX3H結構域組成，且其上游50個氨基酸處存在1個富含精氨酸區，因此這類基因又稱為RRTZF型鋅指蛋白基因[3]。植物特有TZF基因受多種發育階段和環境信號的影響，在植物中的表達模式呈多樣化[4]。

隨著分子生物學技術的發展及越來越多生物基因組測序的完成，反向遺傳學技術已成為基因功能分析的重要手段。在植物中，常用的反向遺傳學研究手段包括基因過表達、基因敲除/基因打靶、基因沉默（反義RNA和RNAi等）和基因激活等。對功能冗余基因的分析常用基因過量表達方法，基因敲除或基因沉默技術則是基因功能研究的主要方法。CRISPR/Cas9技術[5]是近年新興的一項基因組定點編輯技術，由與特異DNA序列反向互補的sgRNA和核酸內切酶Cas9組成，前者負責識別特異基因靶點，后者實現DNA的切割。該系統無基因序列、細胞類型和物種的限制，簡單高效、費用便宜，受到廣大研究者的青睞[6]。水稻OsTZF3是一個RRTZF型鋅指蛋白基因，其他功能尚未被研究。本研究構建了水稻OsTZF3基因的CRISPR/Cas9敲除和過量表達載體并轉化水稻，為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?植物材料

轉基因受體材料為粳稻（Oryza sativa L.ssp.Japonica）日本晴（Nipponbare）。

1.2?載體與菌株

大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌LBA4404和植物過表達載體pCXUN，均由福建省農業遺傳工程重點實驗室保存。

1.3?主要試劑

CRISPR/Cas9試劑盒（北京唯尚立德公司），primerstar高保真酶、限制性內切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司），Taq DNA 聚合酶、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA測序（上海博尚生物技術有限公司），潮霉素（Roche 公司），組織培養試劑（Sigma公司）。

1.4?CRISPR/Cas9載體構建

載體構建采用北京唯尚立德公司提供的植物 Cas9/gRNA 質粒構建試劑盒（Catalog.No.VK00501），具體步驟如下：1）將合成的gRNA靶點引物對溶解并稀釋成10 μmol·L-1，各取

5 μL加15 μL H2O混合成25 μL最終體系，并按如下程序合成引物二聚體：95℃變性3 min，自然冷卻或在PCR儀中以3℃·min-1的速率降至25℃，16℃ 5 min。2）取Cas9/gRNAVector 1 μL、引物二聚體1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10× T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、H2O 6 μL，混合成10 μL反應體系，16℃水浴2 h，獲得引物二聚體與載體的連接產物。3）取連接最終產物5～10 μL，熱激法轉入DH5a感受態細胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養基上，次日挑取3～5個白色單菌落搖菌培養并測序，測序引物序列5′AGCCATGAATAGGTCTATGAC 3′。獲得正確的引物二聚體與VK00501連接的最終敲除表達載體，并電激轉化農桿菌LBA 4404，于-80℃下保存備用。

1.5?過表達載體構建

以日本晴基因組DNA為模板，用TZF3F和TZF3R引物（表1）及高保真酶（PrimeSTAR）PCR擴增獲得OsTZF3基因全長。用Xcm I酶切pCXUN質粒，獲得3′末端突出一個T堿基的線性骨架載體，與OsTZF3基因的PCR產物連接，經酶切和測序驗證后獲得正確的OsTZF3植物過表達載體并電激轉化農桿菌LBA 4404，于-80℃下保存備用。

1.6?水稻遺傳轉化

以日本晴的幼胚誘導愈傷組織，并用于隨后的轉化。水稻愈傷組織的誘導、繼代及與農桿菌的共培養，抗性愈傷組織的篩選及再生等相關的培養基和具體的試驗步驟參照文獻[7]進行。

1.7?轉化植株的檢測

以CTAB法[8]提取葉片基因組DNA為模板，PCR擴增篩選轉基因植株，PCR引物如表1所示。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min;94℃變性45 s，56～60℃退火45 s（溫度依據GC含量高低而定），72℃延伸45 s至3 min（時間根據擴增長度而定，1 kb·min-1），共35個循環;72℃延伸10 min。

2?結果與分析

2.1?OsTZF3基因的生物信息學分析及gRNA靶序列的設計

水稻OsTZF3基因包含1個外顯子，CDS全長2250 bp，編碼749個氨基酸，含有1個CHCH和1個TZF模體。將其CDS序列輸入CRISPR/Cas9靶點設計軟件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）獲得一系列gRNA靶序列（長度為20 bp），選取位于TZF模體上游的靶序列，在NCBI中進行同源比對分析，確定了1條與水稻基因組中其他序列同源性較低的gRNA靶序列5′AGCCACCAGACGCCGCACAG 3′，在該gRNA靶序列5′末端加上接頭CAG，其反向互補序列5′末端加上接頭AAC，構成1對完整的gRNA靶點引物，并送往上海博尚生物技術有限公司合成。

2.2?CRISPR/Cas9敲除載體的獲得

將上述合成的gRNA靶點正反義引物按照材料與方法1.4所述，首先引物經過變性退火形成具有黏性末端的引物二聚體，然后與具有同樣黏性末端的線性骨架載體VK00501連接，通過熱激法轉化大腸桿菌，挑單克隆測序獲得了gRNA 在CRISPR/Cas9骨架載體中正確插入的重組子，命名為pKTZF3，進一步通過電激法將構建正確的重組載體導入農桿菌感受態細胞LBA4404，經過菌液PCR鑒定正確的單菌落，保存于-80℃保存備用。

2.3?過表達載體 pCXUNTZF3的獲得

設計OsTZF3基因全長引物TZF3F和TZF3R（表1），以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶（TaKaRa）PCR擴增獲得OsTZF3基因全長。PCR產物膠回收后用普通Taq酶加A尾巴，通過TA克隆方法與pCXUN線性載體連接，轉化大腸桿菌感受態DH5α，涂布于含卡那霉素的LB培養基上。挑單菌落搖菌提質粒后，經酶切鑒定獲得正向連接的重組載體，并送往公司測序，獲得序列正確的載體，命名為pCXUNTZF3。電激法導入農桿菌感受態細胞LBA4404，使用菌液PCR擴增目的基因，能獲得目的片段的單菌落保存于-80℃保存備用。

2.4?農桿菌介導的水稻遺傳轉化

將構建好的質粒pKTZF3轉化到粳稻日本晴胚性愈傷組織中，獲得了轉化再生植株55個克隆，CTAB法提取每個再生植株基因組DNA，用表1的CZF和CZR引物PCR擴增，其中35個克隆能擴增出目的條帶。進一步對上述能擴增出目的條帶的PCR擴增產物進行測序，結果顯示所有PCR陽性植株均含有本試驗設計的gRNA靶序列，說明了gRNA靶序列成功導入水稻基因組中。同時，以上述鑒定的35個克隆轉基因植株為模板，用KTZF3F2 和KTZF3R2引物PCR擴增靶突變區，送往公司測序發現35個轉基因植株中均未檢測到靶基因突變，暗示了該gRNA序列的活性低或不具有活性。

另外，將構建好的過表達載體pCXUNTZF3轉化粳稻日本晴胚性愈傷組織，共獲得轉化再生植株42個克隆，CTAB法提取再生植株基因組DNA，用UbiF和KTZF3R2引物PCR擴增其中10個田間種植成活的轉化再生植株，結果顯示均能擴增出預期條帶，說明成功獲得了OsTZF3基因的過表達轉基因水稻。

3?討論與結論

植物RRTZF型鋅指蛋白基因在植物生長發育及脅迫反應中起著重要的作用。在擬南芥的RRTZF型鋅指蛋白基因的功能研究中發現此類基因具有功能冗余現象，過量表達是功能冗余基因分析的常用方法，但過量表達容易出現異位表達，基因敲除克服RNAi擬敲除技術抑制不徹底的缺陷，因此過量表達技術結合基因敲除技術可以更準確地反映冗余基因的功能。本研究成功構建了水稻RRTZF型鋅指蛋白基因OsTZF3敲除表達載體和過量表達載體，并通過農桿菌介導法，獲得了35個轉敲除載體的轉基因水稻和10個克隆的轉過表達載體的轉基因水稻，為進一步研究OsTZF3基因的生物學功能奠定了基礎。

CRISPR/Cas9技術是近年新興的一項切割效率極高的基因組定點編輯技術，是基因功能研究中的一種非常有效的工具。雖然該CRISPR/Cas9系統幾乎能剪切PAM序列（NGG）之前的任何序列，但對于預測的所有靶位點并不是總能成功進行編輯。CRISPR/Cas9系統的切割效率受到gRNA的影響，Liang等[9]認為植物中有活性的gRNA序列具有以下4個特點：①gRNA序列G/C含量為30%～80%;②gRNA二級結構除莖環1外，其他結構必須完整;③與其他gRNA序列的同源性12個堿基，保守區小于或等于7個堿基;④gRNA序列自身堿基配對小于或等于6個。本研究對OsTZF3基因的gRNA序列進行分析，雖然gRNA序列均滿足上述有活性gRNA序列特點，但對其獲得的35個轉基因植株進行靶突變區檢測卻未發現突變體。由于植物基因組編輯需要花較長時間才能獲得轉基因植株，因此除了對gRNA序列進行評估外，還需多設計幾個gRNA序列，以保證獲得具有靶基因突變的植株。

參考文獻：

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[8]MURRY MG，THOMPSON WF.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res，1980，8（19）：4321-4326.

[9]LIANG G，ZHANG H，LOU D，et al.Selection of highly efcient sgRNAs for CRISPR/Cas9based plant genome editing[J].Scientific Reports，2016，6：21451，DOI：10.1038/srep21451.

（責任編輯：柯文輝）