太子參蕪菁花葉病毒時(shí)空動(dòng)態(tài)定性初步檢測(cè)

趙云青 黃穎楨 陳菁瑛 朱景花 劉保財(cái) 張武君

摘?要：為明確柘榮縣太子參攜帶蕪菁花葉病毒情況，采用RTPCR法對(duì)不同太子參植株進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)。結(jié)果表明：同株太子參有無(wú)病斑的葉片、根部、莖部都可檢測(cè)到病毒;未表現(xiàn)病毒癥狀與表現(xiàn)病毒癥狀太子參植株的9個(gè)部位均可檢測(cè)到病毒，未表現(xiàn)病毒癥狀的太子參植株中葉脈及莖下部病毒含量相對(duì)較高;不同海拔地區(qū)種植的太子參植株10個(gè)部位均可檢測(cè)到病毒，花部位的病毒含量相對(duì)較少;對(duì)不同生長(zhǎng)期太子參定株葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)末期部分植株未檢測(cè)到病毒，除此之外所取樣品均攜帶蕪菁花葉病毒。

關(guān)鍵詞：柘榮縣;太子參;蕪菁花葉病毒;RTPCR;檢測(cè)

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.009

Abstract：In order to clarify the situation of turnip mosaic virus carried by radix pseudostellariae in Zherong County， RTPCR was used to detect turnip mosaic virus in different plants of radix pseudostellariae. The results showed that viruses in could be detected in leaves， roots and stems of the same plant with or without disease spots. Viruses Radix pseudostellariae?could be detected in 9 parts of plants with and without viral symptoms， while the content of viruses in middle veins and lower stems of plants without viral symptoms was relatively higher. Viruses in Radix pseudostellariae could be detected in 10 parts of plants at different altitudes， but the virus content in flower parts was relatively lower. Virus detection on the leaves of fixed plants of radix pseudostellariae at different growth stages showed that no virus was detected in some plants at the end of growth stage. In addition， all the samples carried turnip mosaic virus.

Key words：Zherong County; Radix pseudostellariae; Turnip mosaic virus; RTPCR; Detection

太子參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax，又稱孩兒參，為石竹科假繁縷屬多年生草本藥用植物，其塊根為常用補(bǔ)益中藥，具有益氣健脾，生津潤(rùn)肺之功效，在治療肝炎、糖尿病、冠心病、心絞痛、繼發(fā)性再生障礙性貧血、白細(xì)胞減少癥、甲亢、淋巴結(jié)核等難治病癥方面取得新進(jìn)展[1]，臨床用途非常廣泛，近年來(lái)用量劇增。太子參是福建省的道地藥材，柘榮縣是全國(guó)太子參的主產(chǎn)區(qū)。柘榮縣位于福建省東北部，介于北緯27°05′～27°19′、東經(jīng)119°43′～120°04′，屬中亞熱帶季風(fēng)山地氣候，屬中山、低山類型區(qū)，土壤以紅壤和黃壤為主，偏酸性，年均溫15.5℃，年降雨量1985 mm，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，晝夜溫差大，適合太子參種植，柘榮縣人工栽培太子參已有近百年的歷史，被譽(yù)為中國(guó)太子參之鄉(xiāng)，全縣90%農(nóng)戶種植太子參，太子參產(chǎn)業(yè)是柘榮縣傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)，太子參產(chǎn)量長(zhǎng)期占全國(guó)的50%以上。當(dāng)家品種柘參2號(hào)在柘榮縣已推廣種植10年，由于長(zhǎng)期采用無(wú)性繁殖方式，種質(zhì)退化嚴(yán)重，且病毒病田間發(fā)病率高，嚴(yán)重影響太子參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

太子參病毒病又稱花葉病，在江蘇、山東、福建等主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，田間發(fā)病率和種根帶毒率非常高，病毒病田間表現(xiàn)為病株矮小，葉上出現(xiàn)斑駁花葉，葉片皺縮，塊根小，根數(shù)明顯減少。據(jù)報(bào)道[2-3]，目前已知太子參病毒病侵染病毒種類有4種，分別為蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broad bean wili virus，BBMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），其中蕪菁花葉病毒是危害福建省柘榮地區(qū)太子參生產(chǎn)最嚴(yán)重的病毒。根據(jù)調(diào)查，太子參產(chǎn)區(qū)從太子參出苗就會(huì)表現(xiàn)癥狀并逐漸擴(kuò)展蔓延，到5月上旬發(fā)病達(dá)到高峰，田間基本全部表現(xiàn)出病毒病癥狀，更甚者會(huì)導(dǎo)致絕收。黃穎楨等[4]研究發(fā)現(xiàn)，感染蕪菁花葉病毒的太子參植株各個(gè)部位均有病毒分布，而關(guān)于未表現(xiàn)病毒病癥狀的太子參植株是否攜帶病毒，以及太子參生長(zhǎng)期中蕪菁花葉病毒是否有差異等問(wèn)題尚無(wú)相關(guān)定性檢測(cè)。為此，本研究采用RTPCR[4]方法對(duì)不同太子參植株進(jìn)行病毒檢測(cè)，以期為柘榮縣太子參病毒病防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品采集

于2015年田間取帶病毒病癥狀及不帶病毒病癥狀的太子參植株，經(jīng)鑒定為太子參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax。樣品采集方法列于表1。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?太子參同一植株有無(wú)病斑葉片及不同部位蕪菁花葉病毒檢測(cè)?3月4日，取海拔550 m的太子參植株，對(duì)同一植株上的有病斑葉片、無(wú)病斑葉片、根部和莖部分別進(jìn)行取樣檢測(cè)。

1.2.2?表現(xiàn)與不表現(xiàn)病毒病癥狀太子參植株蕪菁花葉病毒檢測(cè)?3月20日，取海拔200 m表現(xiàn)病毒病癥狀和未表現(xiàn)病毒病癥狀的太子參帶花植株，分別對(duì)其葉肉、葉脈、花、莖上部、莖中部、莖下部、根上部、根中部、根下部和須根等10個(gè)部位進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)。

1.2.3?不同海拔地區(qū)太子參植株蕪菁花葉病毒檢測(cè)?3月20日、4月3日采集海拔200、400、550、800、900 m地區(qū)種植、有表現(xiàn)病毒病癥狀的太子參植株進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)。

1.2.4?太子參不同生長(zhǎng)期蕪菁花葉病毒定株檢測(cè)?在湖頭村徐家?guī)X、英山鄉(xiāng)鳳洋村、鴛鴦草場(chǎng)3個(gè)地方分別定株8株進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)，從4月17日開始，約每隔半個(gè)月取樣1次，共取樣5次，取樣部位為葉片。

1.3?檢測(cè)方法

太子參植株蕪菁花葉病毒RTPCR檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

2?結(jié)果與分析

2.1?太子參同一植株有無(wú)病斑葉片及不同部位蕪菁花葉病毒檢測(cè)

對(duì)太子參同一植株上的有病斑葉片、無(wú)病斑葉片、根部和莖部分別進(jìn)行取樣檢測(cè)，結(jié)果表明，蕪菁花葉病毒在各組織中均可擴(kuò)增得到目的條帶，說(shuō)明在太子參同一植株上的有病斑葉片、無(wú)病斑葉片、根部、莖部都分布蕪菁花葉病毒，且根據(jù)條帶亮度比較4部分病毒含量無(wú)明顯差異。

2.2?表現(xiàn)與不表現(xiàn)病毒癥狀太子參植株蕪菁花葉病毒檢測(cè)

取海拔200 m表現(xiàn)及未表現(xiàn)病毒癥狀的太子參帶花植株，分別對(duì)其葉肉、葉脈、花、莖上部、莖中部、莖下部、根上部、根中部、根下部和須根10個(gè)部位進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)，結(jié)果表明，未表現(xiàn)病毒癥狀的植株在9個(gè)部位中均可檢測(cè)到蕪菁花葉病毒，在葉脈及莖下部檢測(cè)到的病毒條帶最亮，病毒含量相對(duì)較多，葉肉、根上部蕪菁花葉病毒含量相對(duì)較少;表現(xiàn)病毒癥狀的太子參植株9個(gè)部位均可檢測(cè)到蕪菁花葉病毒，且引物檢測(cè)的條帶亮度高，病毒含量都相對(duì)較多。

2.3?不同海拔地區(qū)太子參植株蕪菁花葉病毒檢測(cè)

3月20日對(duì)海拔200、400、550、800、900 m地區(qū)種植的表現(xiàn)病毒癥狀的太子參植株進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2b、圖4，結(jié)果表明在不同海拔地區(qū)種植的太子參植株不同組織部位均可檢測(cè)到蕪菁花葉病毒。對(duì)海拔400 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行檢測(cè)，其葉脈與莖上部檢測(cè)到的條帶最亮，含病毒相對(duì)較多。對(duì)海拔550 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行檢測(cè)，其花部位檢測(cè)到的蕪菁花葉病毒條帶較暗，病毒含量相對(duì)較少，而莖上部、根上部、根中部病毒含量相對(duì)較多。對(duì)海拔800 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行檢測(cè)，其葉脈檢測(cè)到的引物條帶最暗，含病毒量相對(duì)最少。海拔900 m地區(qū)種植的太子參植株不同部位檢測(cè)到的引物條帶較暗，僅莖中部、莖下部病毒含量相對(duì)較多。

4月3日對(duì)海拔200、400、550、800、900 m地區(qū)種植、表現(xiàn)病毒癥狀的太子參植株進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果如圖5。結(jié)果表明，海拔200 m地區(qū)種植的太子參植株引物檢測(cè)顯示條帶亮度高，病毒含量都相對(duì)較高;對(duì)海拔400 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行檢測(cè)，其葉肉與葉脈部位的條帶亮度相對(duì)較暗，病毒含量相對(duì)較低，其他部位含量都相對(duì)較高;海拔550 m地區(qū)種植的太子參帶花植株各個(gè)組織部位檢測(cè)到的條帶亮度均較高，全株病毒含量都較高;在海拔550 m地區(qū)表現(xiàn)病毒癥狀的太子參有花植株的花、根下部及須根部位檢測(cè)到的條帶較暗，病毒含量相對(duì)較少，莖中部、莖下部、根上部病毒含量相對(duì)較多;對(duì)海拔800 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行病毒引物檢測(cè)，結(jié)果顯示條帶亮度高;對(duì)海拔900 m地區(qū)種植的太子參植株進(jìn)行檢測(cè)，其花部位的條帶最暗，莖上部的條帶最亮，莖上部病毒含量相對(duì)較多。

2.4?太子參不同生長(zhǎng)期蕪菁花葉病毒定株檢測(cè)

從圖6可知，湖頭村徐家?guī)X除缺失一次取樣外，8株太子參植株每個(gè)時(shí)期都可檢測(cè)到蕪菁花葉病毒，且第5、6、8株太子參蕪菁花葉病毒含量始終相對(duì)較多。在英山鄉(xiāng)鳳洋村，除缺失一次取樣外，8株太子參植株每個(gè)時(shí)期都可檢測(cè)到蕪菁花葉病毒，且第3、4株在不同生長(zhǎng)期病毒含量一直相對(duì)較多。在鴛鴦草場(chǎng)定株的8株太子參中，第2、5株在生長(zhǎng)末期幾乎檢測(cè)不到病毒，第1、3株在太子參生長(zhǎng)末期病毒含量相對(duì)較少。

3?結(jié)論與討論

本研究采用RTPCR法對(duì)太子參同一植株有無(wú)病斑的葉片、根部、莖部，未表現(xiàn)病毒癥狀與表現(xiàn)病毒癥狀太子參植株的10個(gè)部位，不同海拔地區(qū)種植太子參植株10個(gè)部位進(jìn)行蕪菁花葉病毒檢測(cè)，結(jié)果表明太子參均攜帶蕪菁花葉病毒，其中花部位的病毒含量相對(duì)較少，其他部位病毒含量多少并無(wú)明顯規(guī)律。對(duì)不同生長(zhǎng)期定株的太子參葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)，整個(gè)生長(zhǎng)期中太子參蕪菁花葉病毒含量多少并無(wú)規(guī)律，但在生長(zhǎng)末期太子參攜帶蕪菁花葉病毒含量相對(duì)較少。本研究結(jié)果表明，柘榮縣種植的太子參無(wú)論是否表現(xiàn)病毒癥狀，無(wú)論高海拔地區(qū)還是低海拔地區(qū)種植的太子參都可檢測(cè)出蕪菁花葉病毒。太子參蕪菁花葉病毒是太子參生產(chǎn)中非常嚴(yán)峻的問(wèn)題，如何進(jìn)行太子參病毒病的防治需要多學(xué)科綜合研究，特別是進(jìn)行種苗脫毒并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等研究，更需要相關(guān)科研院所及生產(chǎn)企業(yè)通力合作。本研究?jī)H通過(guò)RTPCR法進(jìn)行太子參蕪菁花葉病毒的定性檢測(cè)，下一步將通過(guò)建立太子參蕪菁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，并結(jié)合相對(duì)定量法[5]，對(duì)太子參植株攜帶蕪菁花葉病毒的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，以期為太子參的無(wú)毒栽培研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖培根，李大鵬，楊世林.新編中藥志（第一卷）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：191-193.

[2]宋榮浩，濮祖芹.太子參病毒病病原鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1991，7（2）：80-85.

[3]吳朝峰，林彥銓.藥用植物太子參的研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，34（4）：426-430.

[4]黃穎楨，陳菁瑛，朱景花，等.太子參中蕪菁花葉病毒的RTPCR檢測(cè)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31（6）：616-619.

[5]簡(jiǎn)熠，周倩，王錫鋒，等.白背飛虱體內(nèi)南方水稻黑條矮縮病毒定量檢測(cè)體系建立[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016（35）：366-372.

（責(zé)任編輯：林玲娜）