佛手標準湯劑中兩種成分的測定方法研究

孫福仁 高晗 李雪利 張肖建 李軍山 李振江

摘要：為提高佛手配方顆粒的質量評價標準，利用佛手標準湯劑控制佛手配方顆粒的內在質量。以15批不同產地的佛手飲片為原料，制備佛手標準湯劑，建立含量測定方法，以柚皮苷、橙皮苷為指標成分，測定了15批佛手標準湯劑的相關含量。結果表明：柚皮苷、橙皮苷分別在0.0251～0.1255，0.1605～0.8023μg范圍內線性關系良好（r=0.9999），平均加樣回收率分別為102.27%和101.48%，重復性考察RSD值分別為0.78%和0.89%，12h穩定性考察RSD值分別為0.59%和1.46%。所提出的方法能同時測定柚皮苷和橙波苷兩種成分，節約了分析時間，提高了佛手產品的質量標準。

關鍵詞：中藥化學;佛手標準湯劑;橙皮苷;柚皮苷;含量測定

中圖分類號：R284.1文獻標志碼：A

doi：10.7535/hbgykj.2019yx03012

文章編號：1008-1534（2019）03-0221-06

佛手系蕓香科植物佛手的干燥果實，具有梳理肝氣、止痛、和胃的功效[1]，為常用理氣中藥。成熟佛手果實中含有檸檬油素、5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、7-羥基-6-甲氧基香豆素、4-甲氧基聯卞、檸檬內酯、Δ5，22-豆甾烯醇、棕櫚酸等成分[2-3]。現代藥理學研究表明：佛手具有降低脂質代謝、降低總膽固醇、促進糖脂代謝等生物活性[4-6];佛手醇提液具有顯著鎮咳、平喘、祛痰作用，可提高機體的抗應激能力[7]。

關于佛手中相關含量的測定研究，文獻[8]和文獻[9]介紹了采用RP-HPLC法測定佛手中的橙皮苷含量;金曉玲等[10]測定出佛手飲片中的粗蛋白質量分數為9.37%，氨基酸質量分數為8.334%;曹斯瓊等[11]應用UPLC指紋圖譜方法，對廣佛手飲片、水煎液、配方顆粒進行了相似度評價研究。HPLC指紋圖譜方法的建立，可用于評價佛手質量[12-13]。然而，迄今尚未見有佛手標準湯劑含量測定方法的報道。佛手標準湯劑是以傳統煎煮法為理論依據，經提取制備而成的膏粉或濃縮液，用于衡量佛手配方顆粒的內在質量。筆者收集了不同產地的佛手飲片制備佛手標準湯劑，采用建立的能夠同時測定柚皮苷、橙皮苷含量的測定方法，對15批佛手標準湯劑含量進行了測定。

1主要儀器與材料

CPA225D電子分析天平，德國賽多利斯股份公司提供;KH-7200E超聲波清洗器，江蘇昆山禾創超聲波儀器有限公司提供;WATERSCLASSHUPLC液相色譜儀，AgilentZorbaxEcilpesC18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。

15批不同產地、不同批次的佛手飲片，分別采購于四川、廣東、緬甸、越南、泰國等地，且于不同時間采收加工，經原河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定，確定為蕓香科植物佛手的干燥果實經炮制加工后的飲片，飲片來源及批號見表1。

橙皮苷對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，純度為94.5%;柚皮苷對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，純度為96.5%;甲醇，色譜純，天津科密歐有限公司提供;乙腈，色譜純，天津科密歐有限公司提供;其余試劑均為分析純，水為純化水。

2方法與結果

2.1色譜條件和系統適用性

采用AgilentZorbaxEcilpesC18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），以乙腈-0.1%（體積分數，下同）磷酸為流動相，檢測波長為283nm，柱溫為30℃，流速為0.2mL/min，理論板數按橙皮苷、柚皮苷峰計算應不低于5000[14-15]，測定條件見表2，色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

精密稱定用干燥劑減壓干燥24h的柚皮苷5.51mg、橙皮苷9.73mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密吸取2mL，放入10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1mL含柚皮苷22.0μg、橙皮苷38.9μg的混合對照品溶液。

2.3佛手標準湯劑的制備

取各批次佛手飲片，除去雜質。稱取100g，放入圓底燒瓶中，加入飲片量12倍的水，浸泡30min，加熱煎煮30min。第2次加入飲片量10倍的水，加熱煎煮20min。合并2次煎液，用0.074mm（200目）篩網過濾煎煮液，合并濾液。在高于60℃的溫度下，將佛手提取液用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮至生藥量與濃縮液體積比約為1∶3，再經濃縮液冷凍干燥機干燥，得到干膏粉，即佛手標準湯劑。

2.4供試品溶液的制備

取各批次佛手標準湯劑，粉碎過2號篩。精密稱定0.3g，轉移至具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25mL，超聲（功率為250W，頻率為40kHz）處理10min，再稱定質量。用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

2.5方法學考察

2.5.1標準曲線

分別精密吸取對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0μL，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積。分別以柚皮苷、橙皮苷的進樣量（X）為橫坐標，測定的峰面積（Y）為縱坐標，線性關系結果見表3。結果表明，2種成分在適當范圍內線性關系良好。

2.5.2精密度

取佛手標準湯劑S13樣品，參考供試品制備方法進行處理，依照上述色譜條件連續進樣5次，計算峰面積的RSD值，測定結果見表4。結果表明，柚皮苷與橙皮苷峰面積基本不變，RSD值分別為1.37%和1.52%，說明儀器的精密度良好。

2.5.3穩定性

取佛手標準湯劑S13干膏粉適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件分別于0，2，4，8，12h進樣測定，計算柚皮苷的峰面積，結果見表5。由表5可知，柚皮苷和橙皮苷RSD值分別為0.59%和1.46%（n=5），表明樣品中柚皮苷、橙皮苷在溶液狀態下12h內穩定。

2.5.4重復性

取佛手標準湯劑S13干膏粉適量，分別稱取5份，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取供試品溶液1μL，依照上述色譜條件進行測定，結果見表6。結果表明，供試品溶液中柚皮苷、橙皮苷含量的RSD值分別為0.80%和0.84%（n=5），說明方法的重復性良好。

2.5.5加樣回收率

取同一批干膏粉（S13）9份，精密稱定。分別精密加入一定量的柚皮苷、橙皮苷儲備液，依照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，每份平行測定2次，結果見表7。由表7可知，柚皮苷的平均回收率為102.27%（n=9），橙皮苷的平均回收率為101.48%（n=9）。說明方法的回收率較好，符合要求。

2.6樣品測定

取佛手標準湯劑適量，按照2.4項所述方法制備樣品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷對照品適量，按照2.2項所述方法制備對照品溶液。按上述色譜條件進樣，記錄柚皮苷、橙皮苷峰面積，計算含量，結果見表8。

由表8可知，標準湯劑中柚皮苷與橙皮苷的含量測定和轉移率數據平行性良好。15批佛手標準湯劑中指標成分柚皮苷與橙皮苷含量之和為0.0299%～0.0849%，平均含量為0.0601%，SD值為0.0152%，RSD值為25.28%。柚皮苷與橙皮苷含量之和平均值的70%～130%的范圍為0.0420%～0.0781%，平均值加減3倍SD值的范圍為0.0145%～0.1056%。

3討論

3.1檢測波長的選擇

柚皮苷、橙皮苷紫外光譜圖如圖2所示。由圖2可從看出，柚皮苷、橙皮苷均為黃酮類成分，在紫外多個波段有吸收，283nm波長處有最大紫外吸收，故確定283nm為檢測波長。

3.2提取溶劑的選擇

柚皮苷、橙皮苷2種成分水溶性極差，適宜用有機溶劑提取。考慮到佛手標準湯劑使用水作為提取溶媒、使用100%甲醇作提取溶劑時，膏粉容易結塊，不能完全分散開，經實驗考察，分別使用甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑進行含量比較，發現采用90%甲醇為提取溶劑時的含量最高，故選擇90%甲醇作為提取溶劑。

3.3流動相選擇

分別比較了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸3種流動相，結果發現，采用乙腈-0.1%磷酸為流動相的分離效果較好，故確定其作為流動相。此外，橙皮苷、柚皮苷化學結構類似，極性接近，使用梯度洗脫的方法分析時間較長，故采用梯度洗脫方式分離，可使佛手標準湯劑中的其他成分與目標成分之間實現較好地分離。

4結語

1）《中華人民共和國藥典》2015版中僅介紹了佛手含量測定以橙皮苷單一成分為指標。通過方法摸索，在UPLC設備上建立了能夠同時測定柚皮苷、橙皮苷2種成分的方法，節約了分析時間，提高了質量標準。

2）受佛手產地地理位置的影響，15批佛手飲片中橙皮苷的含量相差較大。標準湯劑以水作為溶媒時橙皮苷的水溶性較差，而15批佛手標準湯劑中柚皮苷與橙皮苷含量之和轉移率范圍為28.01%～43.64%，因此，佛手標準湯劑應以柚皮苷、橙皮苷含量之和作為指標成分。

3）本次研究利用UPLC法，采取梯度洗脫，建立了能夠同時測定柚皮苷和橙皮苷2種成分的分析方法，對文獻報道中的5，7-二甲氧基香豆素的成分也進行了相關分析。然而，由于此成分在佛手標準湯劑中的含量較低，含量轉移率低于5%，故在含量測定指標篩選時，舍去了該成分。黃酮類成分在佛手標準湯劑中所占的量較大，今后需對其作進一步的研究。

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