珍珠燙傷膏干預小鼠潰瘍性結腸炎的作用研究

董遠　來要良　馬致潔　劉永　趙奎君

摘要?目的：探討珍珠燙傷膏對葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導小鼠腸道炎性反應的療效。方法：采用DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）模型，隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪（Mesalazine，Mes）組和珍珠燙傷膏（Pearl Scald Ointment，Pso）低（Pso1）、高劑量組（Pso2），每組10只。給藥10 d，觀察并分析小鼠體質量、結腸長度、病理評分及炎性反應因子等方面的變化。結果：與模型組比較，珍珠燙傷膏各劑量組小鼠的疾病活動指數、結腸病變評分、HE染色病變評分及炎性反應因子水平均顯著下降，由UC引起的體質量及結腸長度縮短均有所改善，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：珍珠燙傷膏對DSS誘導的潰瘍性結腸炎有顯著地改善作用，提示其對潰瘍性結腸炎有一定的治療作用。

關鍵詞?珍珠燙傷膏;潰瘍性結腸炎;灌腸療法;葡聚糖硫酸鈉;美沙拉嗪;疾病活動指數;腫瘤壞死因子;白細胞介素-6;中藥

Therapeutic Effects of Pearl Scald Ointment in Rats with Ulcerative Colitis

Dong Yuan1，Lai Yaoliang2，Ma Zhijie1，Liu Yong2，Zhao Kuijun1

（1 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Beijing Xuanwu Traditional Chinese Medical Hospital，Beijing 100000，China）

Abstract?Objective：To explore the therapeutic effects of Pearl Scald Ointment in rats with ulcerative colitis（UC）induced by dextran sulfate sodium（DSS）. Methods：The UC rats induced by DSS were randomly divided into the normal control（NC）group，model group，Mesalazine（Mes）group，low and high dose groups of Pearl Scald Ointment（Pso）with 10 rats per group. After administration for 10 days，the changes of body weight，colon length，pathological scores and inflammatory factors in rats were observed and analyzed. Results：Compared with the model group，the disease activity indexes，colon lesion scores，HE staining lesion scores and levels of inflammatory factors of rats in each dose group of Pso were significantly decreased. The body weight and shorted colon length caused by UC were improved with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion：Pso has significant improvement effects on rats with UC induced by DSS，which suggests that it has a certain therapeutic effects on rats with UC.

Key Words?Pearl Scald Ointment; Ulcerative colitis; Enema therapy; Dextran Sulfate Sodium; Mesalazine; Disease activity indexes; Tumor necrosis factor; Interleukin-6; Herbal medicine

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.017

潰瘍性結腸炎是一種不明原因的直腸和結腸的慢性非特異性炎性反應。主要臨床表現有：反復腹痛、腹瀉、黏液樣血便等[1]。UC的發病機制尚不明確，一般認為與免疫、遺傳和炎性反應因子等因素有關[2]。現代醫學治療主要以氨基水楊酸類、糖皮質激素類及免疫制劑類藥物為主。這些藥物雖然療效明確，但是也伴隨著不良反應大、易耐藥以及在部分頑固性病例上療效不理想等問題[3]。近些年研發的生物、免疫制劑等新型藥物也因其價格昂貴、易復發等原因，難以完全滿足臨床使用的需要[4]。因此，尋找更加安全、有效、廉價的藥物和治療手段成為近些年研究的重點。

珍珠燙傷膏為北京市宣武中醫醫院院內制劑，其主要由黃芩、黃連、黃柏、大黃、珍珠粉、地龍等藥物組成，具有抗感染，止痛，促進創傷愈合等功效，主要用于燒傷創面的治療。而臨床中發現，使用珍珠燙傷膏灌腸治療潰瘍性結腸炎的療效良好，并具有減少腸道刺激、避免復發等優勢[5]，其在多年的治療使用中積累了豐富的臨床經驗，但目前尚缺乏針對性的基礎研究。

本文采用DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型，觀察并分析實驗前后小鼠體質量、結腸長度、DAI評分、病理評分、炎性因子等方面的變化，以期明確珍珠燙傷膏對潰瘍性結腸炎的治療作用，為臨床的經驗用藥提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級C57小鼠，8周齡，雄性，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）-2016-0002。動物飼養環境為清潔級實驗動物房，20～22 ℃，40%～70% 12 h黑暗/光照循環。動物飼養使用的標準鼠飼料和水以及所有動物實驗均按照首都醫科大學附屬北京友誼醫院動物倫理委員會相關規定進行。

1.1.2?藥物?珍珠燙傷膏（北京市宣武中醫醫院藥劑科提供，生產批號：171123），美沙拉秦腸溶片（Losan Pharma GmbH，德國，生產批號：18A19）。

1.1.3?試劑與儀器?硫酸葡聚糖（Dextran sulphate sodium，36000-50000，MP公司，美國，31404），小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（eBioscience公司，美國，批號：4331720）;小鼠IL-6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（湛江科聯生物技術有限公司，批號：221070422）、多聚甲醛（萬華化學（寧波）有限公司，20180301）。電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：PL-203）;超純水器（Millipore Inc，法國，型號：A10）;SpectraMax酶標儀（Molecular Devices，美國，型號：M3）;超低溫冰箱（Thermo electron，美國，型號：Forma-86C）;鍋旋混合器（上海醫科大學儀器廠，型號：XW-80C）;高速組織勻漿機（IKA，德國，型號：T10）;Leica石蠟切片機（上海萊卡儀器有限公司，型號：RM2016）;光學顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：CKX41）

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?C57小鼠，隨機分為5組：正常組、DSS誘導的UC模型組，陽性藥組美沙拉組，Pso低劑量組和Pso高劑量組。每組動物10只。實驗時間一共為10 d，給藥期及造模期時間和藥物用法用量如表1和圖1所示，正常組及模型組給予相同體積的生理鹽水。模型組小鼠自由飲用2.5%的DSS溶液7 d（每只小鼠每天平均飲水量約為4.3～4.5 mL）[6]。正常飲水飲食，每天更換墊料，保證室溫20～22 ℃造模過程中，每天觀察小鼠狀態，記錄體質量，攝食量。

1.2.2?給藥方法?陽性藥組給以美沙拉嗪腸溶片[50 mg/（kg·d）]，Pso低劑量組給以珍珠燙傷膏5 g/（kg·d）（采用人與小鼠給藥劑量方法折算出小鼠給藥的等效劑量），Pso高劑量組[10 g/（kg·d）]。珍珠燙傷膏采用38 ℃加熱溶化后灌腸給藥[7]。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?疾病活動指數（DAI）評價?在整個實驗過程中，每天9：00及15：00定時檢查小鼠的精神、活動及排便情況，并對小鼠精神狀態、糞便軟硬程度及糞便隱血情況進行記錄，2次/d。根據結果進行疾病活動指數評價。疾病活動指數評價：在造模及給藥期間，每天觀察并記錄小鼠的體質量變化、糞便性狀及便血情況，按照疾病活動指數（DAI）評分標準進行評分。見表2。評分依據為：黏著于肛門的水樣便為稀便，不黏著于肛門的糊狀大便為半稀便，成型大便為正常便。計算方法為：DAI=（體質量下降分值+糞便性狀分值+便血情況分值）/3[8]。

1.2.3.2?結腸長度測定?第10天處死小鼠，取出結腸，用標尺測量結腸長度變化。計算各組平均值及標準偏差，進行相關統計分析。

1.2.3.3?結腸病變評分?第10天處死各組小鼠，取出整段結腸并縱行剖開，用冷生理鹽水沖洗清潔數次，濾紙濾干，展開平鋪并用大頭針固定，肉眼觀察結腸黏膜炎性反應及潰瘍情況，參照表3所列標準進行評分[9]。

1.2.3.4?結腸HE染色及病變評分?取結腸組織，用生理鹽水沖洗腸腔，用4%多聚甲醛固定12 h，常規石蠟包埋、切片、HE染色。染色后觀察組織學改變，根據上皮細胞形態、多少及炎性反應細胞浸潤情況，參照評分標準進行盲法評分[10]。見表4。以小鼠組織學評分作為判斷炎性反應程度的主要標準，由于正常小鼠腸黏膜內也可能有少量白細胞浸潤，因此以組織學分值大于1作為炎性反應產生的病理學基線。由2位病理科醫師分別雙盲閱片，結果取均值。

1.2.3.5?血清中細胞因子測定?造模及給藥期間每日對動物進行檢查和稱重。于第10天留取血液，用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-6含量，具體步驟按試劑盒說明書進行操作[11]。

1.3?統計學方法?采用SPSS 18統計軟件處理數據，實驗結果以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?小鼠的一般情況?空白組小鼠進食、飲水量及活動均正常，無腹瀉便血。模型組小鼠與空白組比較，飲食及活動減少，體質量明顯下降，出現較嚴重的稀便及便血癥狀。共死亡3只。陽性藥組及珍珠燙傷膏低、高計量組小鼠與模型組比較，飲食及活動增多，稀便及便血癥狀有所改善。陽性藥組死亡1只，珍珠燙傷膏低、高劑量組各死亡2只。

2.2?小鼠體質量及疾病活動指數（DAI）變化情況??空白組小鼠飲食、活動及排便情況均正常。模型組小鼠在飲入2.5%DSS后，隨即出現體質量下降，從第4天開始，體質量下降較為明顯，并出現嚴重便血、腹瀉等情況。給予珍珠燙傷膏后，小鼠體質量減輕癥狀有所改善（P<0.05）。見圖2。與空白組比較，模型組DAI評分顯著增高（P<0.05）。Pso低、高劑量組分別與模型組比較，DAI評分均顯著降低（P<0.05），說明珍珠燙傷膏低、高劑量組對小鼠腹瀉、便血及體質量下降等情況均有一定的改善作用。見圖3。

2.3?結腸長度變化?模型組小鼠結腸長度明顯縮短，與正常組比較差異有統計學意義（P<0.05）。給予低、高劑量Pso及陽性藥物后，結腸長度與模型組比較顯著增加（P<0.05）。實驗結果表明珍珠燙傷膏對UC引起的小鼠結腸縮短有改善作用。見圖4。

2.4?結腸病變評分變化情況?結腸病變評分結果表明，正常組小鼠結腸情況正常，未見明顯充血。而模型組小鼠結腸有不同程度的充血，其中部分小鼠結腸出現嚴重的潰瘍，與空白組比較，其病變評分顯著增高（P<0.05）。而Pso低、高劑量組動物腸黏膜損傷情況均有所好轉（與模型組比較差異有統計學意義，P<0.05）。實驗結果表明珍珠燙傷膏對UC引起的小鼠結腸潰瘍有改善作用。見圖5。

2.5?結腸HE染色結果及病變評分?通過HE染色對結腸炎性反應和潰瘍的嚴重程度進行評估。顯微鏡下觀察結果，正常組（如圖6A）小鼠黏膜層腸腺排列緊密，腸腺上皮細胞形態正常（如箭頭1），模型組（如圖6B）小鼠結腸可見明顯潰瘍，黏膜層腸腺及上皮完全喪失，并伴有大量炎性細胞浸潤（如箭頭2），炎性反應侵及黏膜下層及肌層（如箭頭3）;各觀察組（如圖6C-E）小鼠在美沙拉嗪或Pso低、高劑量給藥后，炎性細胞浸潤減少，腸黏膜上皮細胞完整性有所轉歸（如箭頭4），結腸黏膜損傷有所改善。病變評分如圖7所示，與空白組比較，模型組病變評分顯著增高（P<0.05）。與模型組比較，Pso低、高劑量組經給藥后，病理評分顯著降低（P<0.05）。說明珍珠燙傷膏對DSS誘導的UC模型小鼠腸黏膜有一定的修復作用。

2.6?鼠血清中TNF-α、IL-6的含量變化?模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量均顯著高于空白對照組（P<0.05）;陽性藥組及Pso低、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量與模型組比較均顯著降低（P<0.05）。說明珍珠燙傷膏可降低由DSS誘導的UC模型小鼠血清中炎性細胞因子的含量。見圖8、9。

3?討論

潰瘍性結腸炎的發病機制尚不明確，一般認為與免疫、遺傳和炎性反應因子有關。我國的潰瘍性結腸炎患者以中青年為主，病情以輕中度多見[12]。病變部位50%～70%位于直腸及乙狀結腸。病變黏膜的表面呈顆粒狀、彌漫性充血、水腫、灶性出血，潰瘍及糜爛。組織病理檢查可見黏膜及黏膜下層有大量的漿細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤[13]。治療藥物主要以氨基水楊酸類、糖皮質激素類及免疫制劑類為主[14]。但是，因其不良反應較多和價格昂貴等問題，使得這些藥物并不能完全滿足臨床的需要[15]。因此，有更多的臨床醫生開始將目光聚焦在我國傳統中藥方劑上，在中醫藥的寶庫中探尋新的治療方法。

在中醫理論中，潰瘍性結腸炎根據其臨床表現可歸屬于“腸癖”“腸風”“泄瀉”“休息痢”等范疇[16]，各方醫家對于病機的認識雖不甚相同，但都大致可歸結為人體先天不足或后天失和，加之外感時邪、飲食不潔（節）或情志內傷等因素，導致體內氣機運行不暢、水液代謝失調，濕熱內阻大腸而成[17]。中藥治療潰瘍性結腸炎應用健脾益氣、活血化瘀、清熱解毒、燥濕澀腸、止瀉等方法，療效確切，能夠明顯改善患者腹瀉、便血等癥狀，并且痊愈率高、復發率低[18-20]。其中，中藥灌腸治療潰瘍性結腸炎，可使藥物直達病灶，修復潰瘍面，改善血液循環，降低毛細血管通透性從而抑制滲出，改善炎性反應癥狀，并且其避免了口服首過效應，增加了生物利用度，逐漸被人們所重視并加以利用[21]。

臨床發現采用珍珠燙傷膏灌腸治療潰瘍性結腸炎，可以較好地控制炎性反應癥狀，促進潰瘍愈合，尚未發現明顯不良反應。其組成中大黃清熱瀉火，利濕退黃。黃連、黃柏清熱燥濕，其對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等病原微生物有抑制作用。黃芩祛濕熱，其黃芩素、黃芩苷等有效成分具有抗炎作用。珍珠粉可解毒生肌。罌粟殼為澀腸止瀉常用藥，尤適用于久瀉久利，和地龍還可活血化瘀，收斂生肌[22]。諸藥合用，可清熱解毒，去腐生肌，收濕斂瘡，符合UC的中醫辨證。

實驗結果表明，由DSS誘導的UC模型小鼠，在經過珍珠燙傷膏灌腸治療后，疾病活動指數、結腸病變評分及HE染色病變評分均顯著下降，由UC引起的體質量下降及結腸長度縮短均有所改善，同時可以降低血清中炎性細胞因子的含量，說明珍珠燙傷膏對由DSS誘導的UC模型小鼠有一定的治療作用，能夠明顯改善其腹瀉、便血等癥狀，降低結腸炎性細胞浸潤，保護結腸黏膜。在分子水平上，Pso能夠下調DSS誘導的UC小鼠血清中炎性指標IL-6和TNA-α的表達。本實驗初步明確了珍珠燙傷膏治療潰瘍性結腸炎的體內藥效。

綜上所述，通過本實驗結果，明確了珍珠燙傷膏治療UC的藥效，為臨床經驗用藥提供了科學依據，但是其治療UC的分子機制尚不確切，可能與調節結腸黏膜RNA的表達水平、提高SOD活性及降低MDA、MPO等因素有關，故仍須進一步探索研究。

參考文獻

[1]Ford A C，Moayyedi P，Hanauer S B.Ulcerative colitis[J].BMJ，2013，346：f432.

[2]孫平良.基于代謝組學的潰瘍性結腸炎大鼠腸道微生態變化及安腸湯干預機制研究[D].昆明：廣西醫科大學，2017.

[3]王賽，周國華.氨基水楊酸類聯合微生態制劑對潰瘍性結腸炎的維持治療進展[J].實用藥物與臨床，2015，8（4）：463-465，466.

[4]丁棟李，佳妮，齊冉，等，潰瘍性結腸炎的研究進展[J].藥學研究，2017，36（7）：404-408.

[5]白亦冰.珍珠燙傷膏保留灌腸治療慢性非特異性潰瘍性結腸炎40例臨床觀察[J].河北中醫，2016，38（4）：516-518，599.

[6]葛飛.金蕎麥對潰瘍性結腸炎的抗炎作用及機制研究[D].南京：南京中醫藥大學，2016.

[7]袁玲.美沙拉嗪聯合中藥灌腸療法治療潰瘍性結腸炎的效果觀察[J].當代醫藥論叢，2018，16（21）：121-122.

[8]M.Murano，K.Maemura，I.Hirata，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor κB（p65）antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium（DSS）-induced colitis[J].Clinical & Experimental Immunology，2000，20（1）：51-58.

[9]G.M.Ekstrm.Oxazolone-induced colitis in rats：effects of budesonide，cyclosporin A，and 5-aminosalicylic acid[J].Scandinavian Journal of Gastroenterology，1998，33（2）：174-179.

[10]M.Boirivant，I.J.Fuss，L.Ferroni，et al.Oral administration of recombinant cholera toxin subunit B inhibits IL-12-mediated murine experimental（trinitrobenzene sulfonic acid）colitis[J].Journal of Immunology，2001，166（5）：3522.

[11]陳麗.葛根芩連湯對潰瘍性結腸炎小鼠模型腸黏膜內NF-κB、TNF-α、MFG-E8及occludin表達的影響[J].實用醫院臨床雜志，2018，15（6）：12-16.

[12]翟金海.清腸化濕方對潰瘍性結腸炎模型大鼠的影響及機制研究[D].南京：南京中醫藥大學，2013.

[13]Kornbluth A，Sachar DB.Ulcerative colitis practice guidelines in adults（update）：American College of Gastroenterology，Practice Parameters Committee[J].Am J Gastroenterol，2004，99（7）：1371-1385.

[14]張聲生，沈洪.潰瘍性結腸炎中醫診療專家共識意見（2017）[J].中華中醫藥雜志，2017，32（8）：3585-3589.

[15]袁宇婷，劉維明，曹麗.中醫藥治療潰瘍性結腸炎的研究進展[J].湖南中醫雜志，2018，34（4）：167-169.

[16]王敏勇，從脾失健運論中醫對慢性潰瘍性結腸炎的臨床治療[J].中國醫院藥學雜志，2016，36：90.

[17]陳曉麗，費建平.辨證治療慢性非特異性潰瘍性結腸炎研究進展[J].河北中醫，2014，36（2）：316-318.

[18]殷潔.潰結灌腸液與柳氮磺吡啶栓治療潰瘍性直腸炎的臨床對比研究[D].南京：南京中醫藥大學，2012.

[19]許秀芬，何泮，李桂云，等.中藥灌腸治療潰瘍性結腸炎的臨床觀察[J].光明中醫，2018，33（1）：57-58.

[20]楊勇，周源，趙娟，等.固腸止瀉丸干預潰瘍性結腸炎模型大鼠的實驗研究[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（65）：3-5.

[21]林明武，柯曉.中藥灌腸治療潰瘍性結腸炎的研究進展[J].北京中醫藥，2008，27（2）：144-146.

[22]朱春洋，張聲生教授治療潰瘍性結腸炎經驗的數據挖掘及臨床療效評價研究[D].北京：北京中醫藥大學，2017.