小傘山羊草染色體的FISH核型分析

2 張素勤2

(1.貴州大學農學院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心， 貴州 貴陽550025)

山羊草屬(Aegilops)植物主要分布于小亞細亞、巴基斯坦、地中海和中亞，現在歐洲、非洲大陸、地中海沿岸、帕米爾高原和中亞西亞廣為分布[1]。普通小麥(TriticumaestivumL.)由3個染色體組組成，其中B和D 2個染色體組來源于山羊草屬，山羊草屬與小麥屬(Triticum)的親緣關系最近，山羊草屬幾乎所有的種均可與小麥雜交[2]。山羊草屬含有許多對改造栽培小麥品質及農藝性狀十分有價值的基因，例如抗葉銹病、條銹病、赤霉病、白粉病及眼斑病、早熟、抗倒伏、抗蟲害、抗寒、抗旱、高蛋白質等優異基因，是小麥改良的1個豐富基因庫，在小麥進化中起著重要作用[2-3]。小傘山羊草(Aegilopsumbellulata，UU，2 n=2 x=14)是山羊草屬二倍體物種，該物種的U基因組是小麥和相關物種的幾個基本基因組之一[4-6]。充分發掘、利用小傘山羊草的優良基因，通過遠緣雜交技術導入小麥對提高栽培小麥品質與抗性等具有重要意義。

熒光原位雜交(Fluorescence in Situ hybridization，FISH)技術是遠緣雜種鑒定、異源多倍體起源及進化等相關研究的有力工具[7]。通過DNA重復序列可以用于染色體辨別、基因組組成及進化分析，外源遺傳物質檢測等多項研究[8]。Adonina 等[9]對擬斯卑爾脫山羊草(Aegilopsspeltoides)雜交后代的染色體組進行了FISH核型分析。Schneider[10]等采用pAs 1和pSc 119.2探針對小麥-山羊草附加系的染色體進行了FISH鑒定。Tang等[11-12]開發出的寡核苷酸Oligo-pSc 119.2-1與Oligo-pTa-535-1探針可以作為有效區分小麥及其遠緣物種的染色體。宮文萍等[13]用Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1和(GAA)8為探針的FISH分別對小麥-單芒山羊草雙二倍體和中國春-單芒山羊草附加系進行了分析，并建立了其FISH核型。董磊等[14]利用Oligo-pTa 535和Oligo-pSc 119. 2探針對多份擬斯卑爾脫山羊草進行FISH分析，準確區分擬斯卑爾脫山羊草的不同染色體，建立了擬斯卑爾脫山羊草的FISH核型。本試驗以寡核苷酸Oligo-pSc 119.2-1與(GAA)7重復序列為探針的雙色FISH技術對小傘山羊草根尖細胞染色體進行核型分析，以期得到小傘山羊草的FISH核型，為小麥遺傳研究及新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為小傘山羊草(Aegilopsumbellulata，UU，2 n=2 x=14)，具有早熟、耐逆，抗銹病、白粉病，抗蚜蟲等優點，保存于國家小麥改良中心貴州分中心實驗室。

1.2 染色體制片

將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中于常溫下發芽，待根長至2 cm左右時，剪取根尖用N2O處理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min，用蒸餾水沖洗3遍后切取根尖分生區置于37 ℃水浴酶解50 min，用70%酒精沖洗3遍，搗碎根尖后加入冰醋酸滴片，在顯微鏡(OLMPUS BX 60)下鏡檢，選取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 熒光原位雜交分析

FISH技術參照Han等[15]的方法，小傘山羊草的染色體命名參照Friebe等[6]和Mirzaghaderi等[16]的方法。Oligo-pSc 119.2-1(綠色)與(GAA)7(紅色)探針由Thermo Fisher Scientific(上海)公司合成。選擇FISH效果好的細胞用Cellsens Standard攝像系統照相。選取5個分裂相好且染色清晰的細胞用于FISH核型分析，以得到準確可靠的數據。

2 結果與分析

本試驗分別以Oligo-pSc 119.2-1(綠色)與(GAA)7(紅色)重復序列為探針對小傘山羊草根尖細胞染色體進行了FISH分析(圖1)。結果發現，小傘山羊草共包含7對染色體，其中1 U和5 U染色體各含有1對隨體。Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在染色體的端部與近端部，不同染色體之間的信號強度有所差別。(GAA)7信號較Oligo-pSc 119.2-1的亮度高，而且分布更豐富，許多染色體著絲點附近(GAA)7信號尤其強烈。

注：Oligo-pSc 119.2-1探針為綠色，(GAA)7探針為紅色；背景染色體由DAPI復染為藍色；比例尺為10 μm。圖1 小傘山羊草根尖細胞染色體的FISH核型

小傘山羊草1 U染色體兩端部具有清晰的Oligo-pSc 119.2-1綠色信號(圖2)；著絲點處有(GAA)7紅色信號。2 U染色體上Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號則位于著絲點處、長臂中間與端部。3 U染色體上信號豐富，明亮的Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號處于著絲點附近、長臂中間與近端部。4 U染色體上Oligo-pSc 119.2-1信號位于染色體兩端部；(GAA)7信號較豐富，主要分布在著絲點處，短臂中間及端部。5 U染色體在著絲點與長臂近端部有(GAA)7信號。6 U染色體上(GAA)7信號位于染色體著絲點、長臂端部、短臂近端部，其中長臂端部信號最為明亮；Oligo-pSc 119.2-1信號只有1對，因與長臂端部(GAA)7強信號重疊而不易辨認。7 U染色體上存在較多的Oligo-pSc 119.2-1與(GAA)7信號，其中Oligo-pSc 119.2-1信號位于長臂中間與短臂端部；(GAA)7信號分別分布在著絲點處、長臂中間及短臂端部。

圖2 小傘山羊草U基因組的FISH核型

Oligo-pSc 119.2-1信號主要分布在小傘山羊草染色體兩端部，表明該U基因組的端部常含有pSc119.2重復序列。因為小傘山羊草的一些(如1 U、2 U、3 U和4 U)染色體的Oligo-pSc 119.2-1信號具有相似性，所以只采用Oligo-pSc 119.2-1探針的單色FISH不能鑒別所有染色體。將Oligo-pSc-119.2-1與(GAA)72種探針配合使用可以有效地鑒別每一染色體。

3 討 論

小麥遠緣雜交可將野生植物的基因導入小麥中，豐富小麥的基因庫，以創造出新的小麥種質資源及優良小麥新品種[17]。小麥遠緣雜交是染色體工程的基礎，而山羊草屬是小麥遠緣雜交的重要材料，小麥與山羊草屬遠緣雜交可獲得小麥新資源。Mirzaghaderi等采用pSc 119.2探針對小傘山羊草進行了FISH核型分析，發現pSc 119.2信號主要分布于染色體端部[16]。本試驗利用Oligo-pSc-119.2-1探針對小傘山羊草進行了FISH分析，也發現Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在染色體的端部，獲得了與Mirzaghaderi等[16]相似的結果；但是5 U和6 U染色體上Oligo-pSc-119.2-1信號存在差別，可能是試驗材料不同的緣故。

小麥中GAA-衛星序列的雜交模式與N帶模式相同[18]，N帶模式與C帶基本相同[19]。Friebe等[6]對小傘山羊草進行C-帶帶型分析，發現在染色體著絲粒處都存在C-帶，其余分布在端部，臂中間部位的C-帶較少。本試驗小傘山羊草(GAA)7信號與Friebe等[6]建立的C-帶核型圖有相似性，但也有一些不同，如2 U、3 U、4 U和 7 U染色體的(GAA)7信號與C-帶都分布較廣，在染色體臂與著絲點處都存在；而1 U和5 U染色體的(GAA)7信號則較C-帶少，其原因是C帶技術主要顯示染色體上的異染色質，其含有大量豐富的高度重復的DNA順序，而(GAA)7只是1種DNA重復序列。小傘山羊草FISH核型與C-帶核型圖相比，探針信號與染色體背景反差大、條帶豐富、視覺效果明顯好于C-帶核型，有效提高了染色體核型分析的效果[14]。

本試驗Oligo-pSc-119.2-1信號主要分布在小傘山羊草染色體的端部與近端部。(GAA)7信號主要集中于染色體著絲點與近著絲點處，不但比Oligo-pSc-119.2-1信號的亮度強，分布豐富，而且在染色體上的分布可與Oligo-pSc-119.2-1信號互補。因此將Oligo-pSc-119.2-1與(GAA)72種探針配合使用以準確地辨別小傘山羊草的所有染色體，建立了小傘山羊草的FISH核型，可為小麥遺傳育種提供參考。