丹紅注射液對糖尿病合并腦缺血大鼠的神經保護作用及Nrf2/HO-1通路的影響*

郝宏錚 王愛平 王 麗 孫海波

（遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

腦缺血導致神經元死亡，主要發生在尾狀核，殼核背外側區，海馬CA1區和脊髓區。糖尿病患者卒中發生率高于正常人群［1-2］?；钚匝酰≧OS）通過激活轉錄因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）在增強炎癥中起重要作用。研究表明，神經細胞對氧化應激的反應涉及Nrf2，Nrf2在調節Ⅱ期基因中起重要作用［3］。在基礎條件下，由于單個Nrf2蛋白和Keap1之間的相互作用，Nrf2與細胞質中的Keap1結合［4-5］。暴露于許多應激物和誘導劑導致Nrf2從Keap1解離，從而從蛋白酶體降解中拯救Nrf2并允許進入細胞核。因此，Nrf2的激活被認為是細胞保護劑的重要分子靶標［6］。血紅素加氧酶-1（HO-1）是Nrf2的下游調控因子，也被認為是氧化應激的重要調控酶［7］。丹紅注射液由丹參、紅花、注射用水組成，具有活血化瘀，通脈舒絡的功能，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風，對缺血性腦病、腦血栓均有較好療效；丹紅注射液廣泛應用于創傷性顱內血腫，肝靜脈閉塞性疾病和心肌再灌注損傷，其通過抗凝血，抗血栓形成，抗纖維蛋白溶解和抗氧化活性證明了對腦缺血的保護作用［8-9］。本研究擬觀察丹紅注射液對糖尿病合并腦缺血大鼠的神經保護作用及Nrf2/HO-1通路的影響，為糖尿病合并腦缺血的治療提供理論及臨床依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供體質量250～300 g的健康成年Sprague-Dawley大鼠100只［許可證號：SCXK（遼）2018-0013］。 動物飼養室適應22～26℃，濕度40%～70%，光暗周期12/12 h。在整個實驗期間自由攝取飼料、自由飲水。

1.2 分組與造模 根據隨機數字表法隨機分成5組：對照組、模型組、丹紅注射液低（10.0 mg/kg）、中（20.0 mg/kg）、高劑量組（40.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。通過單次腹膜內（i.p.）注射新鮮溶解于pH4.5的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中的55 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ，S0130，Sigma，USA）誘導糖尿病。72 h后測量血糖水平。

1.3 試藥與儀器 丹紅注射液（國藥準字Z20026866，山東丹紅制藥有限公司）、鏈脲佐菌素（STZ，S0130，Sigma，USA）、戊巴比妥鈉（99.9%，Sigma）、Trizol試劑（美國賽默飛世公司）、一步法RT-PCR擴增試劑盒（上海生工）、NRF2、HO-1、β-肌動蛋白引物由上海生工科技有限公司合成、NRF2一抗（1∶100，Abcam，UK，ab119339，批次：GR264335-1）、HO-1（馮維勒布蘭德因子）二抗（1∶100，Abcam，UK，ab6994批次：GR223933-3）、NRF2標記抗小鼠二抗（1∶100，中國金杉，中國，ZF-0312，批次：112242）、HO-1標記抗兔二抗（1∶100，中國杉木，中國，oZF-0317，批次116128）、DAP（I1 ng/μL；Sigma-Aldrich，Poole，UK，批號D9542）、CFX96實時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。

1.4 給藥方法 糖尿病組包括血糖水平超過18 mmol/L的大鼠（模型組及丹紅注射液各劑量組）。注射等體積檸檬酸鹽緩沖液的年齡匹配的非糖尿病大鼠用作非糖尿病對照［血糖（4.22±1.25）mmol/L］。大鼠在缺血誘導前一晚禁食，但可自由飲水。在模型組及丹紅注射液各劑量組中誘導持續15 min的前腦缺血。麻醉由3%戊巴比妥鈉注射誘導15 min瞬時前腦缺血通過夾住雙側頸總動脈與45～50 mmHg出血性低血壓（通過放血誘導）相結合誘導。通過重新灌注流出的血液并釋放放置在頸動脈周圍的結扎線來恢復循環。丹紅注射液各劑量建模成功后第1天開始給予相應藥物灌胃，持續給予18周，對照組和模型組給予等體積生理鹽水。對大鼠神經缺失癥狀進行評分。

1.5 標本采集與檢測 1）制作大鼠脊髓HE切片，計算神經細胞存活率，即正常細胞占細胞總數的百分比，以5個視野的平均值作為最終的神經細胞存活率。2）大鼠脊髓組織中NRF2、HO-1 mRNA水平的測定。RT-qPCR測量NRF2、HO-1 mRNA水平。提取各組大鼠腦mRNA。mRNA逆轉錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，NRF2（上游 5′-AGTATGTGGCGGGCTGCTT CG-3′，下游5′-GGAAATAATGAGAGGGAGGA T-3′），HO-1引物（上游5′-AACTTTGCCTGTTACCT TC-3′，下游5′-CAGTCACAATCTGACCTCC-3′），β-肌動蛋白引 物（上 游 5′-CGGCAGTCGCCTTGGACGTT-3′，下游 5′-GCCCTTTCCCATCTCAGCAGCC-3′）（Primer Express，Applied Biosystems；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）用于qPCR，β-肌動蛋白用作內參基因。使用2-ΔΔCT方法進行定量。3）NRF2、HO-1蛋白在大鼠海馬組織的表達水平測定。取大鼠腦脊髓組織，常規甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明。將切片在10%正常山羊血清（溶于PBS中）中在室溫下封閉1 h。用PBS洗滌5 min。然后將NRF2抗體（1∶100，Abcam，UK，ab119339，批號 GR264335-1）和 HO-1抗體（1∶100，Abcam，UK，ab6994，批號GR223933-3）混合并添加至組織中。在4℃過夜。切片用PBS洗滌3次，每次5 min。抗小鼠二抗（1∶100，中國金杉，中國，ZF-0312，批號112242）和抗兔二抗（1∶100，中國杉木，中國，oZF-0317，批號116128）混合并加入組織中，37℃孵育1 h。用PBS洗滌3次，每次5 min。將切片與室溫下染細胞核2 min，然后用PBS洗滌5 min。以高放大倍數（400倍）觀察500個細胞。4）ELISA測定大鼠脊髓組織中蛋白水平。ELISA法測定MDA、NO、SOD蛋白水平。

1.6 統計學處理 應用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（）表示，行單因素方差分析，隨后兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠神經缺失癥狀評分、神經細胞存活率比較 見表1。與對照組比較，丹紅注射液各劑量組神經缺失癥狀評分升高（P＜0.05），神經細胞存活率降低（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組神經缺失癥狀評分降低（P＜0.05），神經細胞存活率升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經缺失癥狀評分、神經細胞存活率比較（±s）

表1 各組大鼠神經缺失癥狀評分、神經細胞存活率比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組治療后比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20神經缺失癥狀評分（分）0.00±0.00 14.54±2.95△10.12±1.48*△7.01±1.63*△4.13±0.96*△神經細胞存活率（%）98.63±6.09 52.24±8.98△66.99±5.54*△78.21±6.35*△89.69±8.79*△

2.2 各組大鼠脊髓神經元結構的比較 見圖1。對照組脊髓區神經元細胞完整，神經纖維結構緊密、分布均勻、排列整齊、髓鞘薄厚均勻、結構正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央；模型組脊髓區可見神經纖維排列疏松、多處發生變性及斷裂、大量壞死神經元、細胞核固縮；丹紅注射液高劑量組脊髓區見少量壞死神經元細胞，變性與斷裂顯著減少、髓鞘著色不均勻，局部仍有炎癥反應發生；丹紅注射液中、低劑量組較模型組而言，壞死神經元細胞減少，但經元疏松紊亂，細胞核固縮，脫失現象明顯，具有明顯的劑量依賴效應。

圖1 各組大鼠脊髓神經元結構（400倍）

2.3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達比較 見表2。與對照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較見表3、圖2～圖3。與對照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。免疫組化法下，Nrf2、HO-1陽性表達為棕褐色，Nrf2、HO-1陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。

表2 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）

組別對照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 Nrf2 mRNA 1.13±0.21 2.18±0.19△1.89±0.18*△1.52±0.09*△1.16±0.19*HO-1 mRNA 1.76±0.17 0.98±0.12△1.09±0.17*△1.12±0.16*△1.73±0.20*

表3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較（±s）

組別對照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 Nrf2 47.13±15.95 187.66±9.47△165.14±12.74*△132.23±10.73*△65.45±18.76*HO-1 83.67±15.63 271.14±16.78△223.73±13.65*△163.17±99.69*△101.58±13.74*

圖2 各組大鼠脊髓區NRF2蛋白表達水平（HE染色，400倍）

圖3 各組大鼠脊髓區HO-1蛋白表達水平（HE染色，400倍）

2.5 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達比較 見表4。與對照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織MDA、NO蛋白表達水平明顯升高，SOD蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組MDA、NO蛋白表達水平明顯降低，SOD蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

組別對照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 MDA 78.98±16.32 326.21±19.69△201.36±15.32*△136.32±18.32*△81.32±24.36*NO 123.65±23.21 413.65±13.69△302.67±19.32*△203.36±17.32*△129.68±36.69*SOD 599.36±18.63 289.36±18.34△392.39±15.39*△459.25±19.99*△5 893.26±26.39*

3討論

丹紅注射液是一種標準化的水溶性產品，采用現代技術從中草藥丹參和紅花中提取。丹參、紅花是名貴中草藥，廣泛用于治療心腦血管疾病。丹紅注射液成分復雜，由原兒茶醛、咖啡酸、丹參素、5-羥甲基-2-糠醛、丹酚酸D、丹酚酸B、丹酚酸A、精酸、阿魏酸和迷迭香酸組成［10-11］。本實驗表明，與模型組比較，丹紅注射液各劑量神經缺失癥狀評分降低，神經細胞存活率升高。這提示丹紅注射液顯著減少了糖尿病合并腦缺血大鼠引起神經缺失癥狀，并提升了神經細胞存活率。結合病理學結果，丹紅注射液高劑量組脊髓區見少量壞死神經元細胞，變性與斷裂顯著減少、髓鞘著色不均勻，局部仍有炎癥反應發生。這說明丹紅注射液能減輕糖尿病合并腦缺血大鼠脊髓神經元損傷程度。

抗氧化/親電子反應元件（ARE/EpRE）調節的Ⅱ期解毒酶和抗氧化劑是抵抗增加的氧化應激和維持許多組織中氧化還原狀態的主要抗氧化途徑之一［12］。HO-1是催化血紅素降解為膽綠素，碳氧化物（CO）和鐵的限速酶，是ARE調節的Ⅱ期解毒酶和抗氧化劑之一，受到氧化還原敏感的轉錄因子核因子紅細胞2相關因子（Nrf2）的調節［13］。HO-1基因表達的調節發生在多個水平上并且是誘導物特異性的。在轉錄水平，HO-1由轉錄因子Nrf2介導。在生理條件下，Nrf2被Keap1隔離在胞質溶膠中，并且靶向蛋白酶體降解。在存在親電子或ROS的情況下，Nrf2從Keap1釋放，然后易位到細胞核中，激活靶基因（包括HO-1）的轉錄。Nrf2對腦缺血再灌注損傷中的神經元和血管變性具有保護作用［14］。據報道，HO-1在其啟動子上具有最多的ARE，使其成為預防腦缺血神經損傷的高效治療靶標。HO-1的過表達在轉基因小鼠的永久性大腦中動脈閉塞模型（MCAO）中具有神經保護作用［15］。此外，HO-1的藥理學誘導已被證明可以保護視網膜免受急性青光眼誘導的缺血再灌注損傷。本研究結果顯示，與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白表達水平、MDA、NO蛋白表達水平明顯降低，SOD蛋白表達水平明顯升高。這提示丹紅注射液抑制Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白的表達水平激活抗氧化途徑，降低氧化應激產物水平，進而對糖尿病合并腦缺血大鼠的神經起保護作用。

綜上所述，丹紅注射液顯著減少糖尿病合并腦缺血大鼠引起的神經缺失癥狀，減輕脊髓神經元損傷程度；其機制與抑制Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白的表達水平激活抗氧化途徑，降低氧化應激產物水平有關。