地黃飲子湯對rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達的影響*

劉王波 彭 禹 馬 瑞 方志成

（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

急性腦梗死（ACI）發(fā)病率和死亡率很高，嚴重威 脅人類健康［1］。ACI的病理基礎(chǔ)為急性局灶腦缺血，腦血管內(nèi)皮細胞受損，血腦屏障功能喪失，缺血性腦組織發(fā)生細胞凋亡和壞死［2］。腦梗死急性期，缺血區(qū)中央帶神經(jīng)元在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生不可逆壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀，導致神經(jīng)元凋亡和生物功能喪失［3］。細胞凋亡是基因調(diào)控細胞程序性死亡的過程［4］。B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的主要功能是抑制細胞凋亡。研究表明，Bcl-2基因表達和蛋白質(zhì)水平降低將顯著增加細胞凋亡水平和加重神經(jīng)功能障礙［5-6］。Caspase是凋亡通路的中心環(huán)節(jié)，Caspase-3參與受體和線粒體凋亡通路，可在細胞表面相互作用，介導細胞凋亡［7］。因此，抑制腦梗死半暗區(qū)細胞凋亡可保護神經(jīng)功能。ACI唯一被認可的治療方法是在癥狀出現(xiàn)后的前4～5 h內(nèi)用重組組織纖溶酶原激活劑（rt-PA）溶栓，然而，溶栓后再灌注可加重缺血區(qū)神經(jīng)細胞凋亡和壞死，引起繼發(fā)性損傷［8］。地黃飲子湯具有滋腎陰、補腎陽、開竅化痰的功效，在治療缺血性腦血管疾病方面取得了一定療效，但其作用機制研究較少［9］。因此，本研究通過檢測地黃飲子湯對rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達的影響，探討其治療ACI的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取體質(zhì)量200～240 g的雄性8周齡SD大鼠40只，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證號：SZXK（京）2011-00120。在SPF環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗，動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 試藥與儀器 地黃飲子湯（熟地黃、山茱萸肉、石斛、巴戟天、肉蓯蓉、白茯苓、炮附子、肉桂、五味子各30 g，麥冬、菖蒲、遠志各15 g，生姜3片和大棗2枚為配伍，用12倍水煎煮2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)濃縮成生藥量為2.5 g/mL的湯劑，冰箱貯存?zhèn)溆茫?；rt-PA（德國勃林格殷格翰制藥有限公司）；凍干人凝血酶（上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；戊巴比妥（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；三苯基四氮唑（TTC）（美國Biosharp公司）；白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；TRIzol（天根生化科技有限公司，中國）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司，中國）；熒光定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司，中國）；Bcl-2、Bax、Caspase-3引物由大連TaKaRa公司設(shè)計并合成：Bcl-2上游引物為5′-CCCGTTGCTTTTCCTCTGG-3′，下游引物為 5′-ATCCCACTCGTAGCCCCTCT-3′；Bax上游引物為 5′-GACGAACTGGACAGTAACATGGA-3′，下游引物為5′-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-3′；Caspase-3上游引物為5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′，下游引物為 5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物為 5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物為：5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′；激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，Sweden）（上海永州實驗設(shè)備有限公司）；光學顯微鏡（日本Nikon公司）；HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；病理切片機、包埋機、脫水機（德國Leica公司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司）；實時熒光定量PCR儀（美國BD公司）。

1.3 分組及造模 將40只大鼠用隨機數(shù)字表法均分為4組：假手術(shù)組、模型組、rt-PA組和地黃飲子湯組。每組用5只大鼠進行血液采集和TTC染色、5只進行細胞凋亡和mRNA檢測。大鼠術(shù)前12 h禁食，用戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后沿進行開顱，切除了硬腦膜，暴露了大腦中動脈（MCA）。模型組、rt-PA和地黃飲子湯組將含有1 mL純化鼠凝血酶（1.5 UI）的微管插入MCA分叉的管腔內(nèi)，仔細注射，誘導原位血栓形成。注射10 min后移除了移液管，此時血塊已經(jīng)穩(wěn)定。用激光多普勒血流檢測儀檢測左側(cè)大腦血流變化，當凝血酶注射時，腦血流速度從基線下降到至少60%，并且在至少20 min內(nèi)保持穩(wěn)定時，血凝塊被定義為成功。假手術(shù)組只開顱不進行相關(guān)操作。

1.4 給藥方法 造模結(jié)束20 min后rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠尾靜脈注射rt-PA（10 mg/kg），地黃飲子湯組同時灌胃給予地黃飲子湯（5 g/kg），其余組給予等量0.9%氯化鈉注射液。2 h后半夏瀉心湯組以5 g/kg進行灌胃，對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液。24 h后處死大鼠進行相關(guān)檢測。

1.5 標本采集與檢測 1）TTC染色。大鼠心臟取血后分離完整腦組織，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。2）ELISA法檢測血清中IL-6和TNF-α水平。對血液進行離心，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書進行IL-6和TNF-α水平測定。3）TUNEL法檢測細胞凋亡。腦組織進行石蠟包埋，切片（2.0 μm），經(jīng)脫蠟、酒精梯度脫水后，按TUNEL法檢測細胞凋亡說明書進行細胞凋亡檢測。使用熒光顯微鏡檢測凋亡細胞（綠色熒光染色），最后用碘化丙啶（PI）反染細胞核，計數(shù)綠色和紅色熒光細胞，計數(shù)陽性細胞率。4）RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達。取約0.1 g腦組織，用液氮充分研磨后加入1 mL TRIzol進行總RNA提取，然后合成cDNA，制備20 μL反應(yīng)體系進行擴增。以 GADPH 作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用IBM SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率的比較 見表1，圖1～2。與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率增高（P＜0.05）；與模型組比較，rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與rt-PA組比較，地黃飲子湯組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積和細胞凋亡率比較（%，±s）

與假手術(shù)組相比較，#P＜0.05；與模型組相比較，*P＜0.05；與rt-PA組相較，△P＜0.05。下同

細胞凋亡率0.42±0.06 4.81±0.23#2.94±0.26#*1.85±0.20#*△組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n 5 5 5 5大鼠腦梗死體積0.00±0.00 37.51±5.43#29.97±3.14#*18.64±2.07#*△

圖1 各組大鼠腦梗死體積

圖2 各組大鼠細胞凋亡情況

2.2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平均增高（P＜0.05）；與模型組比較，rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低（P＜0.05）；與rt-PA組比較，地黃飲子湯組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平比較（ng/L，±s）

組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n 5 5 5 5 IL-6 123.19±15.02 463.57±26.26 281.49±30.09#*198.34±22.04#*△TNF-α 31.57±4.38 201.84±26.19#136.46±15.41#*75.54±9.20#*△

2.3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平的比較 見表3。與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠腦組織中Bcl-2 mRNA表達降低，Bax和Caspase-3 mRNA表達水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠腦組織中Bcl-2 mRNA表達增高，Bax和Caspase-3 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與rt-PA組比較，地黃飲子湯組大鼠Bcl-2 mRNA表達增高，Bax和Caspase-3 mRNA表達水平降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n5 5 5 5 Bcl-2 1.00±0.06 0.57±0.06 0.69±0.09#*0.84±0.04#*△Bax 1.00±0.04 2.84±0.19#1.98±0.21#*1.54±0.20#*△Caspase-3 1.00±0.07 3.05±0.26#2.71±0.35#*1.94±0.28#*△

3討論

腦梗死屬中醫(yī)學“中風”“卒中”范疇，其病因多為痰濁上泛，下元虛衰，阻塞竅道所致，祛瘀通絡(luò)、化痰瀉濁的方劑可切中其病機［10］。地黃飲子湯具有開竅化痰的功效，在臨床對于風痰瘀阻證患者，取得了滿意的療效。現(xiàn)代藥理學研究也表明，地黃飲子湯具有清除自由基、抗脂質(zhì)氧化的作用［11］。臨床研究表明，地黃飲子湯能顯著清除急性腦梗死患者的自由基，改善血液流變學指標，保護神經(jīng)系統(tǒng)［12］。本研究也顯示，地黃飲子湯可以降低rt-PA溶栓后ACI大鼠的腦梗死體積。筆者推測，其作用機制可能與抑制神經(jīng)細胞的凋亡有關(guān)，因為再本研究中筆者也檢測到地黃飲子湯組大鼠細胞凋亡明顯受到抑制。

rt-PA治療后最嚴重的并發(fā)癥是出血和血腦屏障破裂。一些實驗研究已經(jīng)證明，rt-PA溶栓治療可能抵消對微循環(huán)的有益影響，這可能與rt-PA介導了血腦屏障（BBB）通透性的增加有關(guān)［13］。腦缺血/再灌注導致促炎介質(zhì)（TNF-α和IL-6）的釋放，進而導致駐留細胞和浸潤細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），從而增加BBB的通透性，促進腦水腫的形成，并導致腦卒中的急性死亡［14］。地黃飲子湯顯著降低了IL-6和TNF-α水平，從而發(fā)揮腦保護作用。

在ACI中，視缺血缺氧程度，細胞可能發(fā)生壞死和凋亡。缺血核心區(qū)的細胞由于長期嚴重缺氧缺血而死亡，這是一個不可逆的過程。在缺血半暗區(qū)，位于缺血灶周圍，缺血程度較低，及時建立側(cè)支循環(huán)，可在一定程度上改善腦功能［15］。近期發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后半暗區(qū)細胞凋亡是治療急性腦梗死的關(guān)鍵，這一過程是可逆的，可抑制細胞功能的恢復(fù)［16］。因此，有效抑制該區(qū)域的凋亡對減少腦細胞凋亡和神經(jīng)功能損傷具有重要意義。細胞凋亡是細胞維持自身穩(wěn)定的重要機制，如果藥物的保護作用及時生效，細胞的凋亡會減少，但細胞死亡的過程也會延遲。

Bcl-2家族在調(diào)節(jié)細胞死亡信號通路中起主要作用。Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要抑制蛋白。對急性腦梗死患者的研究表明，血清中Bcl-2的表達明顯下降，提示患者抗凋亡功能下降［17］。正常情況下，Bcl-2和Bax的表達水平相對穩(wěn)定。然而，當Bax過表達時，Bax二聚體數(shù)量顯著增加，刺激細胞，引起細胞凋亡。當Bcl-2高表達時，Bax二聚體解離形成更穩(wěn)定的Bcl-2和Bax復(fù)合物，從而延長細胞壽命［18］。因此，Bcl-2/Bax的比例在維持細胞存活過程中起著重要作用。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，是參與細胞凋亡的關(guān)鍵酶，通過降解細胞內(nèi)底物激活細胞凋亡通路，導致細胞凋亡。因此，它被稱為“分子開關(guān)”，但其活化依賴于細胞色素C的釋放，而Bcl-2家族，包括Bcl-2，可以通過線粒體介導細胞色素C的釋放［19］。本研究結(jié)果也證實了地黃飲子湯能抑制Caspase-3和Bax的表達，促進Bcl-2的表達。

綜上所述，地黃飲子湯可降低缺血性病變體積，降低rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細胞凋亡，從而為地黃飲子湯防治急性腦梗死溶栓后再灌注損傷提供理論依據(jù)。