溫陽健腦方對血管性認知障礙模型大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA的影響*

佟麗妍 艾秀峰 史秀麗 徐煥鳳

（1.浙江省杭州市中醫院，浙江 杭州 310007；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；3.河北省玉田縣計劃生育中心醫院，河北 玉田 064100；4河北省石家莊市長江心理醫院，河北 石家莊050000）

血管性認知障礙（VCI）是1993年Hachinski和Bowlerl［1］提出的基于血管性癡呆的一個概念，是指由腦血管病危險因素（高血壓、糖尿病、高血脂等）、明顯（腦梗死和腦出血等）或不明顯（白質疏松和慢性腦缺血等）的腦血管病引起的從輕度認知障礙到癡呆的一大類綜合征［2］。2011年美國心臟協會/美國卒中協會（AHA/ASA）將VCI的概念變得更為寬泛：指由于腦血管及其危險因素導致的認知損害癥狀由輕度到重度的一系列綜合征。而VCI的提出，是源于對血管性癡呆的早期防治的迫切需要。VCI在全國乃至全世界，是普遍存在的、亟待解決的重要問題，目前國內外尚無有效治療方法。本實驗通過觀察溫陽健腦方中藥制劑對VCI模型大鼠血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和腦組織多巴胺（DA）的影響來探討本方對于VCI的腦保護作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠共46只，鼠齡3～5個月，體質量250～300 g，清潔級，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。合格證號：032582。購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養環境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。大鼠實驗前在動物房環境中適應7 d。

1.2 試藥與儀器 溫陽健腦方：黃芪20 g，淫羊藿10 g，高良姜10 g，遠志15 g，葛根12 g，姜黃12 g，石菖蒲12 g，當歸10 g，川芎12 g。中藥購自杭州市中醫院中藥房，濃煎100 mL，制得生藥含量為2 g/mL的藥液備用。大鼠血清MDA試劑盒（南京建成，cat△A003-1）；大鼠血清SOD試劑盒（南京建成，cat△A001-3）；大鼠腦組織DA試劑盒（南京建成，cat△H170）。超低溫冰箱（青島海爾，型號DW-86L388），水迷宮（淮北正華，型號ZH0065），數碼相機（佳能505D），高通量組織研磨器（寧波新芝，型號SCIENTZ-48），臺式低速自動平衡離心機（上海盧湘儀，型號TDZ6B-WS）。

1.3 模型制備 大鼠適應性飼養1周，造模前，用Morris水迷宮及Zea longa神經功能缺損評分法［3］評估出正常可參與實驗的大鼠，剔除不合格大鼠。取40只大鼠進行造模，采用改良雙側頸總動脈結扎法（2VO法）［4］：大鼠術前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部常規消毒備皮，碘伏消毒后沿正中線切開，鈍性剝離結締組織和頸前肌群，分離雙側頸總動脈；腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg，隨即用無創微動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，灌注10 min，再夾閉10 min，再通后，永久結扎右側頸總動脈，并剪斷，以永久阻斷血流，逐層縫合頸部創口。在手術過程中，保持動物自主呼吸，并保持肛溫（37±0.5）℃。待大鼠蘇醒后依據Zea longa神經功能缺損評分標準篩選，1～4分視為造模成功。造模后3 d，每日肌注10萬單位青霉素鈉抗感染。造模成功SD大鼠共計30只。

1.4 分組及給藥 將30只模型大鼠按照隨機數字表方法分為5組，每組6只；另取6只正常SD大鼠作為空白組。1）空白組：不手術，不喂藥。2）模型組：手術后僅用0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg，每日2次灌胃。3）吡拉西坦組：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg中，每日2次灌胃。4）吡拉西坦+溫陽健腦組：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg中，與溫陽健腦中藥湯劑10 mL/kg，先后灌服，每日2次灌胃。5）溫陽健腦低劑量組：采用溫陽健腦中藥湯劑，給予10 mL/kg，每日2次灌胃。6）溫陽健腦高劑量組：采用溫陽健腦中藥湯劑，給予20 mL/kg，每日2次灌胃。

1.5 神經功能缺損評分 用藥后第14日參照Zea longa評分法給予各組大鼠神經功能缺損評分。0級：無體征，記0分。Ⅰ級：動物不能完全伸直其前肢，記1分。Ⅱ級：動物一側肢體癱瘓，有追尾現象，記2分。Ⅲ級：動物不能站立/打滾，記3分。Ⅳ級：無自發性活動，有意識障礙，記4分。

1.6 Morris水迷宮實驗 用藥后第14日對每組大鼠進行Morris水迷宮實驗［5-6］。首先進行定位航行試驗：訓練前使大鼠在水池內自由游泳2 min，以熟悉環境。第1日：可視平臺試驗。實驗前將大鼠籠放入測試房間適應至少30 min，期間避免其看到水池。實驗時，輕輕抓住大鼠尾根，使其面對池壁，從離平臺最遠的象限入水，記錄大鼠找到平臺的潛伏期，時間為90 s。如果大鼠在規定時間內找到平臺，讓其在平臺上停留5 s，如果大鼠在規定時間內未找到平臺，讓其在平臺上停留20 s。實驗結束，吹干毛發，將大鼠放回籠中飼養。第2至第5日：隱藏平臺試驗。訓練時間共4 d，每天固定時間進行4次訓練，每次90 s，每次間隔20 s（每只大鼠隨機從每個象限的中點面壁式入水1次），如果90 s仍未找到站臺，由操作者將大鼠引上站臺休息20 s，訓練后吹干毛發，將大鼠放回籠中飼養。圖像采集系統及分析系統自動記錄保存大鼠的運動軌跡、找到站臺的潛伏期（escape latency）、游泳時間、游泳速度、游泳距離及尋找站臺的搜尋策略等信息。

1.7 標本采集與檢測 Morris水迷宮實驗完畢，予每組大鼠斷頭處死，分別取血以檢查血清SOD、MDA，取其腦組織，置冰盒上，于視交叉與視乳頭之間冠狀位處垂直切開腦組織，鈍性分離出兩側海馬，分別稱重，按質量和體積比1∶10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿。血液靜置30 min后，和組織勻漿均在4℃，3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液，參照生化試劑盒說明書的檢測方法檢測血清MDA、SOD和腦組織DA。

1.8 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，進行方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結 果

2.1 一般情況 大鼠模型復制完成后，均出現神經功能障礙，第2日多數模型大鼠口鼻有血性分泌物，表現為毛發干枯，精神倦怠，反應遲鈍，蜷縮懶動，部分左側肢體偏癱，并有多只死亡，解剖死亡的大鼠發現右腦水腫嚴重。大鼠腦水腫癥狀在24～72 h左右達到高峰期，隨后逐漸恢復。

2.2 各組大鼠神經功能缺損評分比較 用藥14 d后空白組、模型組、吡拉西坦組、吡拉西坦+溫陽健腦組、溫陽健腦低劑量組、溫陽健腦高劑量組大鼠神經功能缺損評分分別為0分、（3.17±0.75）分、（1.83±0.75）分、（0.67±0.52）分、（1.00±0.63）分、（0.83±0.75）分。模型組、吡拉西坦組、溫陽健腦低劑量組評分均顯著高于空白組（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，吡拉西坦組、吡拉西坦+溫陽健腦組、溫陽健腦低劑量組、溫陽健腦高劑量組評分均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各組大鼠水迷宮隱藏平臺試驗第1日游泳總路程比較 見表1。用藥14 d后隱藏平臺試驗第1日，與空白組比較，各組動物水迷宮游泳總路程及平臺潛伏期均明顯增加，游泳速度減慢（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組游泳總路程均減少，平臺潛伏期縮短，游泳速度增快，其中以溫陽健脾腦高劑量組最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠水迷宮隱藏平臺試驗第1日結果比較（±s）

表1 各組大鼠水迷宮隱藏平臺試驗第1日結果比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白組模型組吡拉西坦組吡拉西坦+溫陽健腦組溫陽健腦低劑量組溫陽健腦高劑量組n 6 6 6 6 6 6路程（cm）360.55±188.95 1 494.38±773.26△△902.53±291.63*△△658.87±372.37**△△566.88±300.85**△518.30±139.21**△游泳速度（cm/s）21.18±2.18 15.21±3.40△△16.83±3.06*△17.55±3.98 17.88±2.60△20.37±3.04*平臺潛伏期（s）53.87±13.07 80.62±17.89△72.63±15.95△52.73±24.55*78.27±20.57△55.37±15.35*

2.4 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較 見表2。與空白對照組比較，模型組血清MDA較空白對照組顯著升高（P＜0.05）；模型組血清SOD及腦組織DA較空白對照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組血清MDA下降，其中溫陽健腦高劑量組血清下降最為顯著（P＜0.01）；各給藥組血清SOD及腦組織DA均上升，其中溫陽健腦高劑量組血清SOD上升最顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較（±s）

組別空白組模型組吡拉西坦組吡拉西坦+溫陽健腦組溫陽健腦低劑量組溫陽健腦高劑量組n 6 6 6 6 6 6 MDA（mol/mg）6.16±5.29 8.86±1.37△1.44±0.71**3.07±3.50**2.71±3.62**0.93±0.40**SOD（U/mg）503.41±131.60 310.42±102.74△398.18±147.72 413.00±144.37 390.19±81.35 451.47±96.92*DA（ng/mL）960.53±375.50 430.25±178.36△△944.93±214.01**863.08±333.70*760.18±279.27**1044.10±323.86**

3討論

VCI患者存在包括記憶障礙在內的多認知域損害，有相關研究表明血管性病灶破壞了與記憶相關的海馬-內側顳葉-皮質下通路是導致這一損害的原因［7］。腦卒中發病次數及梗死面積，尤其發生于額葉、顳葉及丘腦等部位更易引起認知功能障礙［8］。VCI發病的重要因素之一是自由基代謝失衡所致的組織脂質過氧化損傷。MDA是脂質過氧化物的分解產物，是自由基對生物細胞膜損傷后的主要代謝產物，正常情況下體內產生的少量自由基可被抗氧化劑及時清除，維持動態平衡狀態，腦缺血及再灌注時該平衡破壞，引發一系列連鎖反應，導致細胞損傷。DA調節自主運動同時也作用于學習記憶相關的神經元，多巴胺神經系統與工作記憶的關系尤為密切。

中醫學對VCI的定位主要集中在“神志病”范疇，其臨床特點與中醫之“善忘、呆證、腦髓消、文癡”相似。歷代醫家多以肝腎陰虛而辨之，治以滋陰補腎為主，多在中風后遺癥的基礎上治療血管性癡呆，從而忽略了大部分腦缺血后神經功能缺損較輕或無的輕度認知功能障礙的患者，進而失去了治療先機。中醫藥在本病治療方面有其特定的優勢，并能從輕度認知障礙開始，預防和治療認知障礙及癡呆。

本研究結果提示溫陽健腦高劑量組在降低血清MDA及升高血清SOD方面有明顯優勢，比溫陽健腦低劑量組和溫陽健腦+吡拉西坦組及單獨吡拉西坦組均有明顯療效。在提高腦內DA方面，也具有明顯效果，較吡拉西坦及吡拉西坦聯合溫陽健腦組以及單獨溫陽健腦低劑量組的效果均突出。

溫陽健腦方重在溫陽補氣健脾充腦，促進周身各臟器功能的改善，從而達到對腦髓的保養及充實，預防及治療由于氣血不暢、腦髓失養所致之呆證。方中黃芪補氣健脾，具有抗氧化的作用，黃芪總黃酮和總皂苷等成分具有顯著的抗氧化活性［9］，能抑制自由基的產生和清除體內過剩的自由基，阻止新的自由基形成，有類似SOD的作用。淫羊藿總黃酮能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖，使SOD活性升高、MDA含量降低［10］。高良姜醇提物能減少細胞內MDA含量，提高胞內SOD及GGSH-Px的活性，具有較好的抗氧化活性［11］，其歸脾腎經，溫中散寒助淫羊藿補腎而升陽。遠志皂苷元能增強海馬神經元抗氧化能力［12］。石菖蒲對小鼠各種記憶障礙模型均有不同程度的改善作用［13］，還可以提高腦內DA含量。葛根可以通過直接擴張腦血管、增加腦血流量，來提高腦組織和細胞的供血和供氧。葛根升陽的同時可解肌透熱生津，在本方應用大量溫補藥物的同時，給予辛涼對沖，以防陽熱過旺，蒸灼津液而傷陰。姜黃中的姜黃素被認為是一種天然的抗氧化劑，Kunwar等通過研究指出了姜黃素可直接清除體內的氧自由基，減少氧自由基的產生，起到抗氧化作用［14］。當歸、川芎在眾多實驗中均可見到抑制血小板聚集，改善微循環的作用［14-16］。由此可見，本方對VCI的作用主要在于3個方面：一為清除體內氧自由基、抗氧化，因而可以提高SOD，降低MDA含量；二為抗血栓，預防及改善腦血管反復堵塞，從而預防癡呆加重；三為調節腦功能，改善作息節律，使其通過調節大腦作息而迅速恢復認知能力。本實驗團隊將進一步在此基礎上深入研究溫陽健腦方對大鼠認知功能的影響，以進一步明確本方劑的作用機制，并逐漸投入臨床研究，以期獲得更加有力的證據。