基于NCX/SERCA2a平衡假說探討燧心膠囊對心肌梗死后心衰大鼠的心肌保護作用*

郭丹丹 于思明 張鴻婷 趙海燕

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

心力衰竭屬于各類心血管疾病發展的末期階段，發病率、致殘率較高，對患者的生命安全帶來嚴重的威脅［1］。近期研究顯示細胞內鈣調控異常與心力衰竭的發生有關，鈉鈣交換蛋白（NCX）與肌漿網鈣泵2a（SERCA2a）水平的異常是心律失常或心力衰竭發生的共同通路，因此調控心肌細胞鈣離子轉運平衡已成為心力衰竭治療的研究方向［2-3］。燧心膠囊為中藥制劑，具有溫陽利水、益氣活血的功效，經臨床證實可顯著改善心力衰竭患者臨床癥狀，提高患者左室射血分數（LVEF），具有抗心衰的效果［4］，然而燧心膠囊作用機制目前尚不清楚。本研究通過結扎左冠狀動脈前降支法復制心梗后心衰大鼠模型，初步探討燧心膠囊對心力衰竭大鼠心肌NCX/SERCA2a平衡的影響，以期為燧心膠囊的臨床應用提供一定的參考。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，6周齡，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（黑）2018-0018。對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》，所有大鼠均置于統一條件下，12 h交替光照，溫度為25℃，濕度50%～70%，飼養1周后用于模型制備。

1.2 試藥與儀器

燧心膠囊為黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院自制藥，由制附子、紅參、丹參、茯苓、白術、澤瀉組成；卡托普利片（浙江南洋藥業有限公司）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）檢測試劑盒（Solarbio，美國）；氯化三苯硝基四氮唑紅（TTC）染液（sigma，美國）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Abcam，英國）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、RIPA裂解液（碧云天生物技術研究所）；鼠抗NCX、SERCA2a、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Cleaved-Caspase-3、β-actin一抗（Sigma-Aldrich，美國）；HRP二抗（CST，美國）；VevoR1100小動物超聲成像系統（VisualSonics，加拿大）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus，日本）；EC3-410凝膠成像系統（UVP，美國）；CM3050S冷凍切片機（Buffalo Grove，美國）；BX51熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 模型制備

參考文獻［5］方法，通過腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，使大鼠處于仰臥位，胸部備皮后，進行常規消毒；將電極針放置在大鼠四肢皮下，對心電圖進行監測；沿大鼠左側第4/5肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露心臟，在左心耳邊緣下方2 mm處結扎左冠狀動脈前降支；當結扎部位及附近心肌變白，心電圖ST段抬高時，表明結扎成功［6］。另外選取12只大鼠作為假手術組，開胸后僅栓線不進行結扎。正常飼養4周后，采用超聲檢測大鼠LVEF，當LVEF≤50%［7］時，則提示心力衰竭模型大鼠制備成功，排除制備過程中死亡、未達到標準的大鼠，共60只大鼠造模成功。

1.4 分組與給藥

大鼠造模成功后分為模型組及燧心膠囊低、中、高劑量組和陽性藥物組，每組12只，另取12只正常大鼠為假手術組。于造模后次日灌胃相應藥物，燧心膠囊低、中、高劑量組予燧心膠囊水溶液2.7、5.4、10.8 g/kg［8］；陽性藥物組灌胃卡托普利片水溶液5.83 mg/kg［9］，假手術組、模型組灌胃10 mL/kg生理鹽水。各組均連續給藥4周。

1.5 超聲檢測大鼠心室功能

末次給藥后，充分麻醉大鼠，采用小動物超聲儀對大鼠左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、LVEF、左室舒張期后壁厚度（LVPWDd）、左室收縮期后壁厚度（LVPWDs）、左室縮短分數（LVFS）檢測并記錄，連續檢測3次心臟周期求得平均值。

1.6 標本采集與檢測

超聲檢測結束后，尾靜脈取血1 mL，置于抗凝管內，3 000 r/min離心3 min，保存上清置-20℃。各組隨機選取6只大鼠，麻醉后，于頸總動脈逆行注射1 mL 0.5%伊文思藍，迅速處死取出心臟，置于-80℃過夜，用于TTC染色；剩余6只大鼠麻醉后處死，摘除心肌組織，迅速進行左心室重量指數分析，隨后將一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定，其余部分組織切碎后置于液氮中保存。

1.6.1 大鼠左心室質量指數分析 心臟組織經清洗后，濾紙吸干，稱取左心室質量，左心室質量指數（LVMI）=左心室質量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.6.2 血清AngⅡ、ALD水平檢測 取出凍存血清，參照放射免疫檢測試劑盒對血清中AngⅡ、ALD水平進行檢測。

1.6.3 TTC染色評估大鼠心肌梗死 取出凍存心臟，將左心室切成5個2 mm的橫切面，在含有1%TTC的磷酸鹽緩沖液中孵育20 min，正常心肌染色為紫紅色，梗死區域呈淡白色，拍照ImageJ version 1.6軟件定量分析測量梗死體積、總體積，計算梗死體積比例=梗死體積/總體積×100%。

1.6.4 HE染色觀察心肌組織形態 心肌組織在4%多聚甲醛中固定48 h后，經乙醇水合、石蠟包埋后，制備4 μm心肌組織石蠟切片，采用HE染色試劑盒對切片染色，樹脂封片后，置于用光學顯微鏡觀察心肌結構損傷情況。

1.6.5 TUNEL試劑盒檢測心肌細胞凋亡 將心肌組織切片經脫蠟、脫水、再水化后置于含20 μg/mL蛋白酶K緩沖液中，室溫下孵育15 min，PBS沖洗后，添加TUNEL反應液在室溫下孵育1 h，置于熒光顯微鏡鏡下觀察細胞凋亡情況，拍照保存，用Image-J軟件分析對心肌細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=陽性染色細胞數目/總細胞量×100%。

1.6.6 蛋白免疫印跡分析 取出凍存組織研磨后，加入RIPA溶解緩沖液冰上放置30 min，離心后收集上清，BCA法檢測上清液蛋白質濃度。采用10%SDSPAGE電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜上，用含有5%的脫脂牛奶膜封閉，在4℃溫度下，加入一抗稀釋液（1∶500），過夜孵育；37℃下加入二抗稀釋液（1∶5 000）培養1 h，發光顯影后，置于凝膠成像儀中觀察保存蛋白條帶圖，并用Image-J軟件定量分析蛋白條帶表達量。

1.7 統計學處理

應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（）表示，兩組間對比采用t檢驗，多組間對比采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠心肌組織形態學觀察

見圖1。HE染色顯示，假手術組心肌組織結構正常，細胞形態完整，肌原纖維排規則。模型組心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細胞水腫、變形、呈壞死狀，伴有炎性細胞浸潤。燧心膠囊干預各組、陽性藥物組心肌細胞壞死程度降低，炎性細胞浸潤程度減弱。

2.2 各組大鼠心室功能指標比較

圖1 HE染色觀察心肌組織形態學變化（HE染色，200倍）

見表1。與假手術組相比，模型組LVEDD、LVESD均顯著升高，LVPWDs、LVEF、LVFS均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各劑量組與陽性藥物組LVEDD、LVESD均顯著降低，LVPWDs、LVEF、LVFS均顯著升高（P＜0.05）。與陽性藥物組相比，燧心低劑量組LVEDD及燧心低、中劑量組LVESD均顯著升高，燧心低、中劑量組LVEF均顯著降低（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組LVEDD、LVESD、LVEF比較差異具有統計學意義（F=14.086、11.573、19.741，P＜0.05），LVEDD、LVESD隨劑量增加呈下降趨勢，LVEF則呈上升趨勢。

表1 各組大鼠心室功能參數比較（±s）

表1 各組大鼠心室功能參數比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性藥物組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽性藥物組n 6 6 6 6 6 6 LVEDD（mm）5.79±0.84 10.05±0.76*8.78±0.69*#△7.35±0.71*#6.86±0.54*#6.78±0.76*#LVESD（mm）2.95±0.42 8.79±0.96*7.57±0.83*#△6.27±0.76*#△5.64±0.49*#5.37±0.52*#LVPWDd（mm）1.73±0.49 1.65±0.38 1.68±0.39 1.66±0.41 1.63±0.42 1.67±0.43 LVPWDs（mm）3.19±0.51 1.81±0.35*2.24±0.30*#2.35±0.73*#2.54±0.51*#2.58±0.42*#LVEF（%）82.53±10.48 35.65±3.65*43.44±4.82*#△52.36±5.81*#△63.27±5.74*#64.66±6.13*#LVFS（%）43.44±3.39 28.82±2.26*35.75±3.68*#37.13±2.48*#39.06±3.26*#39.15±3.15*#

2.3 各組大鼠心肌梗死體積、左心室質量指數及心肌細胞凋亡的影響

見圖2～圖3，表2。與假手術組比較，模型組心肌梗死體積比例、LVMI、心肌細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽性藥物組心肌梗死體積比例、LVMI、心肌細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）。與陽性藥物組相比，燧心低、中劑量組心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組心肌梗死體積比例、心肌細胞凋亡率比較差異具有統計學意義（F=30.650、53.129，P＜0.05），且隨劑量增加呈下降趨勢。

2.4 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD水平比較

見表3。與假手術組比較，模型組血清AngⅡ、ALD水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽性藥物組血清AngⅡ、ALD水平顯著降低（P＜0.05）。與陽性藥物組比較，燧心低劑量組AngⅡ、ALD顯著升高（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組AngⅡ比較差異具有統計學意義（F=4.634，P＜0.05），且隨劑量增加呈下降趨勢。

圖2 TTC染色評估大鼠心肌梗死體積

圖3 TUNEL法觀察心肌細胞凋亡（100倍）

表2 各組大鼠心肌梗死體積比例、LVMI比較（±s）

表2 各組大鼠心肌梗死體積比例、LVMI比較（±s）

組別假手術組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽性藥物組n 6 6 6 6 6 6梗死體積比例（%）9.65±1.91 40.82±4.68*29.35±1.41*#△20.86±3.47*#△16.31±3.42*#15.05±2.73*#LVMI（mg/g）1.90±0.28 2.82±0.33*2.41±0.29*#2.33±0.26*#2.29±0.27*#2.26±0.25*#凋亡率（%）7.68±1.32 41.27±3.78*28.97±3.51*#△19.24±3.01*#△12.59±1.27*#12.36±1.34*#

表3 各組血漿中血漿AngII、ALD水平比較（μg/L，±s）

表3 各組血漿中血漿AngII、ALD水平比較（μg/L，±s）

組別假手術組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽性藥物組n 6 6 6 6 6 6 AngⅡ156.86±17.19 236.27±15.36*214.12±17.23*#△197.08±16.17*#183.93±18.21*#179.27±16.15*#ALD 231.91±18.13 372.18±20.31*295.11±24.19*#272.07±22.15*#264.71±20.26*#257.93±19.48*#

2.5 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達比較

見圖4，表4。與假手術組比較，模型組心肌組織NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達顯著升高，SERCA2a、Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽性藥物組NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達顯著降低，SERCA2a、Bcl-2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與陽性藥物組比較，燧心膠囊各劑量組NCX及燧心低、中劑量組Bax、Cleaved-Caspase3均顯著升高，燧心膠囊各劑量組SERCA2a及燧心低、中劑量組Bcl-2顯著降低（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3比較差異具有統計學意義（F=52.138、46.654、4.037、32.860、19.629，P＜0.05），且NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3隨劑量增加呈下降趨勢，SERCA2a、Bcl-2呈上升趨勢。

圖4 各組心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達

表4 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽性藥物組n 6 6 6 6 6 6 NCX 0.18±0.04 1.16±0.19*0.82±0.08*#△0.58±0.06*#△0.46±0.04*#△0.32±0.03*#SERCA2a 1.59±0.16 0.23±0.03*0.42±0.07*#△0.57±0.06*#△0.92±0.13*#△1.14±0.13*#Bax 0.88±0.13 2.36±0.29*1.59±0.34*#△1.36±0.15*#△1.22±0.12*#1.16±0.15*#Bcl-2 1.47±0.15 0.26±0.03*0.37±0.05#△0.53±0.11*#△0.86±0.14*#0.93±0.18*#Cleaved-Caspase-3 0.29±0.04 1.27±0.18*1.04±0.11*#△0.82±0.10*#△0.68±0.09*#0.60±0.04*#

3討論

本研究采用左冠狀動脈前降支結扎法復制心梗后心衰大鼠模型，組織學檢測發現模型大鼠心肌梗死體積顯著升高，心肌細胞變性、破裂、壞死，心肌纖維排列紊亂，組織伴有炎性細胞浸潤，提示模型大鼠出現嚴重心肌損傷及心肌炎癥反應，經超聲檢測發現模型大鼠心肌肥大，心臟收縮、舒張功能下降，符合心衰主要表現［10-11］，提示心梗后心力衰竭大鼠模型復制成功。本研究發現模型組大鼠血清中ALD、AngⅡ水平均升高，提示心力衰竭大鼠RAAS系統激活。

中醫學認為心力衰竭主要為“心水”范疇，患者由心氣虛弱發展為心陰虛、心陽虛，臨床多表現為陽虛水泛，因此應以提升陽氣、溫陽利水法進行治療。燧心膠囊主要由制附子、肉桂、黃芪、白芍等組成，其中黃芪為主藥，具有補氣升陽、利水消腫的功效；制附子、肉桂、當歸、白芍為輔藥，具有溫通心陽、補益心血的功效；茯苓、豬苓為佐藥，可化氣行水、上斂肺氣，下滋腎陰，且能引諸藥入心經；全方具有溫通心陽、化氣行水的主要功效。臨床研究顯示慢性心衰患者給予燧心膠囊后，則能改善患者心功能，降低血清炎癥反應，發揮抗心衰的效果［12］。本研究通過給予心力衰竭大鼠燧心膠囊干預后，發現大鼠心肌梗死體積顯著降低，心肌組織損傷程度降低，心臟收縮、舒張能力升高，LVMI降低，血清ALD、AngⅡ水平降低，且高劑量干預組效果與卡托普利相當，提示燧心膠囊可通過抑制RAAS系統激活，提高心室收縮、舒張功能，進而保護心力衰竭大鼠心肌組織，然而其具體作用機制目前尚不清楚。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中凋亡相關基因，Bcl-2表達下調、Bax表達上調導致Bcl-2/Bax平衡失調，激活Caspase級聯反應促進細胞凋亡［13］。本研究發現，給予燧心膠囊干預后，Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增加，提示燧心膠囊干預能通過降低心肌梗死引起的心肌細胞凋亡，從而發揮心肌保護作用。研究顯示，增強NCX鈉離子/鈣離子交換活性可代償SERCA2a對鈣離子攝取功能的降低，進而增強心室收縮、舒張能力；而過度增強鈉離子/鈣離子交換活性則會使鈣離子過度外排，SERCA2a攝取鈣離子減少，造成心臟收縮功能降低［14］。因此NCX/SERCA2a在鈣調節方面不協調，會導致細胞中鈣離子穩態失衡，損傷心臟功能，這即是NCX/SERCA2a平衡假說。Rouhana等研究顯示早期NCX/SERCA2a失衡與壓力超負荷造成的心力衰竭有關［15］。本研究發現心力衰竭大鼠心肌組織中NCX蛋白表達升高，SERCA2a蛋白表達降低，而給予燧心膠囊干預后心肌組織中NCX蛋白表達降低，SERCA2a蛋白表達升高，且具有劑量依賴性，高劑量組與陽性藥物組相當，提示燧心膠囊可通過恢復NCX/SERCA2a平衡，以維持細胞內鈣離子穩態，從而發揮對心力衰竭大鼠心肌保護作用。

綜上所述，燧心膠囊可通過改善NCX/SERCA2a平衡，促進肌漿網鈣離子的攝取以及細胞中鈣離子的泵出，增強心臟功能，降低心肌細胞凋亡，從而發揮對心力衰竭大鼠心肌的保護作用，然而心肌梗死后引發的心力衰竭過程極復雜，涉及的信號通路與調控蛋白還需進行深入研究，以期為疾病的治療提供更充分的理論依據。