基于NCX/SERCA2a平衡假說(shuō)探討燧心膠囊對(duì)心肌梗死后心衰大鼠的心肌保護(hù)作用*

郭丹丹 于思明 張鴻婷 趙海燕

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

心力衰竭屬于各類(lèi)心血管疾病發(fā)展的末期階段，發(fā)病率、致殘率較高，對(duì)患者的生命安全帶來(lái)嚴(yán)重的威脅［1］。近期研究顯示細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控異常與心力衰竭的發(fā)生有關(guān)，鈉鈣交換蛋白（NCX）與肌漿網(wǎng)鈣泵2a（SERCA2a）水平的異常是心律失常或心力衰竭發(fā)生的共同通路，因此調(diào)控心肌細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)平衡已成為心力衰竭治療的研究方向［2-3］。燧心膠囊為中藥制劑，具有溫陽(yáng)利水、益氣活血的功效，經(jīng)臨床證實(shí)可顯著改善心力衰竭患者臨床癥狀，提高患者左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），具有抗心衰的效果［4］，然而燧心膠囊作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法復(fù)制心梗后心衰大鼠模型，初步探討燧心膠囊對(duì)心力衰竭大鼠心肌NCX/SERCA2a平衡的影響，以期為燧心膠囊的臨床應(yīng)用提供一定的參考。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，6周齡，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（黑）2018-0018。對(duì)動(dòng)物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，所有大鼠均置于統(tǒng)一條件下，12 h交替光照，溫度為25℃，濕度50%～70%，飼養(yǎng)1周后用于模型制備。

1.2 試藥與儀器

燧心膠囊為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院自制藥，由制附子、紅參、丹參、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成；卡托普利片（浙江南洋藥業(yè)有限公司）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）檢測(cè)試劑盒（Solarbio，美國(guó)）；氯化三苯硝基四氮唑紅（TTC）染液（sigma，美國(guó)）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Abcam，英國(guó)）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；鼠抗NCX、SERCA2a、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Cleaved-Caspase-3、β-actin一抗（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；HRP二抗（CST，美國(guó)）；VevoR1100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（VisualSonics，加拿大）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus，日本）；EC3-410凝膠成像系統(tǒng)（UVP，美國(guó)）；CM3050S冷凍切片機(jī)（Buffalo Grove，美國(guó)）；BX51熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 模型制備

參考文獻(xiàn)［5］方法，通過(guò)腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，使大鼠處于仰臥位，胸部備皮后，進(jìn)行常規(guī)消毒；將電極針?lè)胖迷诖笫笏闹は拢瑢?duì)心電圖進(jìn)行監(jiān)測(cè)；沿大鼠左側(cè)第4/5肋間剪開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，暴露心臟，在左心耳邊緣下方2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；當(dāng)結(jié)扎部位及附近心肌變白，心電圖ST段抬高時(shí)，表明結(jié)扎成功［6］。另外選取12只大鼠作為假手術(shù)組，開(kāi)胸后僅栓線不進(jìn)行結(jié)扎。正常飼養(yǎng)4周后，采用超聲檢測(cè)大鼠LVEF，當(dāng)LVEF≤50%［7］時(shí)，則提示心力衰竭模型大鼠制備成功，排除制備過(guò)程中死亡、未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，共60只大鼠造模成功。

1.4 分組與給藥

大鼠造模成功后分為模型組及燧心膠囊低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組，每組12只，另取12只正常大鼠為假手術(shù)組。于造模后次日灌胃相應(yīng)藥物，燧心膠囊低、中、高劑量組予燧心膠囊水溶液2.7、5.4、10.8 g/kg［8］；陽(yáng)性藥物組灌胃卡托普利片水溶液5.83 mg/kg［9］，假手術(shù)組、模型組灌胃10 mL/kg生理鹽水。各組均連續(xù)給藥4周。

1.5 超聲檢測(cè)大鼠心室功能

末次給藥后，充分麻醉大鼠，采用小動(dòng)物超聲儀對(duì)大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、LVEF、左室舒張期后壁厚度（LVPWDd）、左室收縮期后壁厚度（LVPWDs）、左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）檢測(cè)并記錄，連續(xù)檢測(cè)3次心臟周期求得平均值。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

超聲檢測(cè)結(jié)束后，尾靜脈取血1 mL，置于抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心3 min，保存上清置-20℃。各組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后，于頸總動(dòng)脈逆行注射1 mL 0.5%伊文思藍(lán)，迅速處死取出心臟，置于-80℃過(guò)夜，用于TTC染色；剩余6只大鼠麻醉后處死，摘除心肌組織，迅速進(jìn)行左心室重量指數(shù)分析，隨后將一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定，其余部分組織切碎后置于液氮中保存。

1.6.1 大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)分析 心臟組織經(jīng)清洗后，濾紙吸干，稱(chēng)取左心室質(zhì)量，左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）=左心室質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.6.2 血清AngⅡ、ALD水平檢測(cè) 取出凍存血清，參照放射免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)血清中AngⅡ、ALD水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3 TTC染色評(píng)估大鼠心肌梗死 取出凍存心臟，將左心室切成5個(gè)2 mm的橫切面，在含有1%TTC的磷酸鹽緩沖液中孵育20 min，正常心肌染色為紫紅色，梗死區(qū)域呈淡白色，拍照ImageJ version 1.6軟件定量分析測(cè)量梗死體積、總體積，計(jì)算梗死體積比例=梗死體積/總體積×100%。

1.6.4 HE染色觀察心肌組織形態(tài) 心肌組織在4%多聚甲醛中固定48 h后，經(jīng)乙醇水合、石蠟包埋后，制備4 μm心肌組織石蠟切片，采用HE染色試劑盒對(duì)切片染色，樹(shù)脂封片后，置于用光學(xué)顯微鏡觀察心肌結(jié)構(gòu)損傷情況。

1.6.5 TUNEL試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 將心肌組織切片經(jīng)脫蠟、脫水、再水化后置于含20 μg/mL蛋白酶K緩沖液中，室溫下孵育15 min，PBS沖洗后，添加TUNEL反應(yīng)液在室溫下孵育1 h，置于熒光顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，拍照保存，用Image-J軟件分析對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞量×100%。

1.6.6 蛋白免疫印跡分析 取出凍存組織研磨后，加入RIPA溶解緩沖液冰上放置30 min，離心后收集上清，BCA法檢測(cè)上清液蛋白質(zhì)濃度。采用10%SDSPAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5%的脫脂牛奶膜封閉，在4℃溫度下，加入一抗稀釋液（1∶500），過(guò)夜孵育；37℃下加入二抗稀釋液（1∶5 000）培養(yǎng)1 h，發(fā)光顯影后，置于凝膠成像儀中觀察保存蛋白條帶圖，并用Image-J軟件定量分析蛋白條帶表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，兩組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，多組間對(duì)比采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

見(jiàn)圖1。HE染色顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完整，肌原纖維排規(guī)則。模型組心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細(xì)胞水腫、變形、呈壞死狀，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。燧心膠囊干預(yù)各組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞壞死程度降低，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減弱。

2.2 各組大鼠心室功能指標(biāo)比較

圖1 HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200倍）

見(jiàn)表1。與假手術(shù)組相比，模型組LVEDD、LVESD均顯著升高，LVPWDs、LVEF、LVFS均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各劑量組與陽(yáng)性藥物組LVEDD、LVESD均顯著降低，LVPWDs、LVEF、LVFS均顯著升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥物組相比，燧心低劑量組LVEDD及燧心低、中劑量組LVESD均顯著升高，燧心低、中劑量組LVEF均顯著降低（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組LVEDD、LVESD、LVEF比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.086、11.573、19.741，P＜0.05），LVEDD、LVESD隨劑量增加呈下降趨勢(shì)，LVEF則呈上升趨勢(shì)。

表1 各組大鼠心室功能參數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠心室功能參數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性藥物組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽(yáng)性藥物組n 6 6 6 6 6 6 LVEDD（mm）5.79±0.84 10.05±0.76*8.78±0.69*#△7.35±0.71*#6.86±0.54*#6.78±0.76*#LVESD（mm）2.95±0.42 8.79±0.96*7.57±0.83*#△6.27±0.76*#△5.64±0.49*#5.37±0.52*#LVPWDd（mm）1.73±0.49 1.65±0.38 1.68±0.39 1.66±0.41 1.63±0.42 1.67±0.43 LVPWDs（mm）3.19±0.51 1.81±0.35*2.24±0.30*#2.35±0.73*#2.54±0.51*#2.58±0.42*#LVEF（%）82.53±10.48 35.65±3.65*43.44±4.82*#△52.36±5.81*#△63.27±5.74*#64.66±6.13*#LVFS（%）43.44±3.39 28.82±2.26*35.75±3.68*#37.13±2.48*#39.06±3.26*#39.15±3.15*#

2.3 各組大鼠心肌梗死體積、左心室質(zhì)量指數(shù)及心肌細(xì)胞凋亡的影響

見(jiàn)圖2～圖3，表2。與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死體積比例、LVMI、心肌細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽(yáng)性藥物組心肌梗死體積比例、LVMI、心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥物組相比，燧心低、中劑量組心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.650、53.129，P＜0.05），且隨劑量增加呈下降趨勢(shì)。

2.4 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD水平比較

見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組血清AngⅡ、ALD水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽(yáng)性藥物組血清AngⅡ、ALD水平顯著降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥物組比較，燧心低劑量組AngⅡ、ALD顯著升高（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組AngⅡ比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.634，P＜0.05），且隨劑量增加呈下降趨勢(shì)。

圖2 TTC染色評(píng)估大鼠心肌梗死體積

圖3 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡（100倍）

表2 各組大鼠心肌梗死體積比例、LVMI比較（±s）

表2 各組大鼠心肌梗死體積比例、LVMI比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽(yáng)性藥物組n 6 6 6 6 6 6梗死體積比例（%）9.65±1.91 40.82±4.68*29.35±1.41*#△20.86±3.47*#△16.31±3.42*#15.05±2.73*#LVMI（mg/g）1.90±0.28 2.82±0.33*2.41±0.29*#2.33±0.26*#2.29±0.27*#2.26±0.25*#凋亡率（%）7.68±1.32 41.27±3.78*28.97±3.51*#△19.24±3.01*#△12.59±1.27*#12.36±1.34*#

表3 各組血漿中血漿AngII、ALD水平比較（μg/L，±s）

表3 各組血漿中血漿AngII、ALD水平比較（μg/L，±s）

組別假手術(shù)組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽(yáng)性藥物組n 6 6 6 6 6 6 AngⅡ156.86±17.19 236.27±15.36*214.12±17.23*#△197.08±16.17*#183.93±18.21*#179.27±16.15*#ALD 231.91±18.13 372.18±20.31*295.11±24.19*#272.07±22.15*#264.71±20.26*#257.93±19.48*#

2.5 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)圖4，表4。與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，SERCA2a、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，燧心膠囊各組與陽(yáng)性藥物組NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，SERCA2a、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性藥物組比較，燧心膠囊各劑量組NCX及燧心低、中劑量組Bax、Cleaved-Caspase3均顯著升高，燧心膠囊各劑量組SERCA2a及燧心低、中劑量組Bcl-2顯著降低（P＜0.05）。燧心膠囊各劑量組NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.138、46.654、4.037、32.860、19.629，P＜0.05），且NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3隨劑量增加呈下降趨勢(shì)，SERCA2a、Bcl-2呈上升趨勢(shì)。

圖4 各組心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組燧心低劑量組燧心中劑量組燧心高劑量組陽(yáng)性藥物組n 6 6 6 6 6 6 NCX 0.18±0.04 1.16±0.19*0.82±0.08*#△0.58±0.06*#△0.46±0.04*#△0.32±0.03*#SERCA2a 1.59±0.16 0.23±0.03*0.42±0.07*#△0.57±0.06*#△0.92±0.13*#△1.14±0.13*#Bax 0.88±0.13 2.36±0.29*1.59±0.34*#△1.36±0.15*#△1.22±0.12*#1.16±0.15*#Bcl-2 1.47±0.15 0.26±0.03*0.37±0.05#△0.53±0.11*#△0.86±0.14*#0.93±0.18*#Cleaved-Caspase-3 0.29±0.04 1.27±0.18*1.04±0.11*#△0.82±0.10*#△0.68±0.09*#0.60±0.04*#

3討論

本研究采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法復(fù)制心梗后心衰大鼠模型，組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌梗死體積顯著升高，心肌細(xì)胞變性、破裂、壞死，心肌纖維排列紊亂，組織伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示模型大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重心肌損傷及心肌炎癥反應(yīng)，經(jīng)超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌肥大，心臟收縮、舒張功能下降，符合心衰主要表現(xiàn)［10-11］，提示心梗后心力衰竭大鼠模型復(fù)制成功。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中ALD、AngⅡ水平均升高，提示心力衰竭大鼠RAAS系統(tǒng)激活。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭主要為“心水”范疇，患者由心氣虛弱發(fā)展為心陰虛、心陽(yáng)虛，臨床多表現(xiàn)為陽(yáng)虛水泛，因此應(yīng)以提升陽(yáng)氣、溫陽(yáng)利水法進(jìn)行治療。燧心膠囊主要由制附子、肉桂、黃芪、白芍等組成，其中黃芪為主藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫的功效；制附子、肉桂、當(dāng)歸、白芍為輔藥，具有溫通心陽(yáng)、補(bǔ)益心血的功效；茯苓、豬苓為佐藥，可化氣行水、上斂肺氣，下滋腎陰，且能引諸藥入心經(jīng)；全方具有溫通心陽(yáng)、化氣行水的主要功效。臨床研究顯示慢性心衰患者給予燧心膠囊后，則能改善患者心功能，降低血清炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗心衰的效果［12］。本研究通過(guò)給予心力衰竭大鼠燧心膠囊干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死體積顯著降低，心肌組織損傷程度降低，心臟收縮、舒張能力升高，LVMI降低，血清ALD、AngⅡ水平降低，且高劑量干預(yù)組效果與卡托普利相當(dāng)，提示燧心膠囊可通過(guò)抑制RAAS系統(tǒng)激活，提高心室收縮、舒張功能，進(jìn)而保護(hù)心力衰竭大鼠心肌組織，然而其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中凋亡相關(guān)基因，Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致Bcl-2/Bax平衡失調(diào)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予燧心膠囊干預(yù)后，Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，提示燧心膠囊干預(yù)能通過(guò)降低心肌梗死引起的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究顯示，增強(qiáng)NCX鈉離子/鈣離子交換活性可代償SERCA2a對(duì)鈣離子攝取功能的降低，進(jìn)而增強(qiáng)心室收縮、舒張能力；而過(guò)度增強(qiáng)鈉離子/鈣離子交換活性則會(huì)使鈣離子過(guò)度外排，SERCA2a攝取鈣離子減少，造成心臟收縮功能降低［14］。因此NCX/SERCA2a在鈣調(diào)節(jié)方面不協(xié)調(diào)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，損傷心臟功能，這即是NCX/SERCA2a平衡假說(shuō)。Rouhana等研究顯示早期NCX/SERCA2a失衡與壓力超負(fù)荷造成的心力衰竭有關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠心肌組織中NCX蛋白表達(dá)升高，SERCA2a蛋白表達(dá)降低，而給予燧心膠囊干預(yù)后心肌組織中NCX蛋白表達(dá)降低，SERCA2a蛋白表達(dá)升高，且具有劑量依賴(lài)性，高劑量組與陽(yáng)性藥物組相當(dāng)，提示燧心膠囊可通過(guò)恢復(fù)NCX/SERCA2a平衡，以維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮對(duì)心力衰竭大鼠心肌保護(hù)作用。

綜上所述，燧心膠囊可通過(guò)改善NCX/SERCA2a平衡，促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣離子的攝取以及細(xì)胞中鈣離子的泵出，增強(qiáng)心臟功能，降低心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用，然而心肌梗死后引發(fā)的心力衰竭過(guò)程極復(fù)雜，涉及的信號(hào)通路與調(diào)控蛋白還需進(jìn)行深入研究，以期為疾病的治療提供更充分的理論依據(jù)。