活血益氣中藥抑制心梗后心衰大鼠左室重構和心肌細胞凋亡的實驗研究*

張海燕 遲春梅 劉天易

（1.山東省青島市即墨區中醫醫院，山東 青島 266200；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東濟南 250100）

心肌梗死為常見多發性心血管病，是一種復雜的臨床綜合征，是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，血小板和凝血功能異常，血栓完全阻塞冠狀動脈所致。心梗后心衰發展過程的重要病理機制為心肌重塑，包括心室大小、形態及細胞水平變化，心肌細胞的缺失和心室重構下降使心臟功能下降［1-2］。研究發現VEGF可形成新的血管，增加血管的通透性，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）下降抑制心肌細胞肥大和膠原產生，內皮素-1

（ET-1）血管收縮劑和促細胞分裂劑，ET-1生成和釋放，刺激肺血管持續收縮［3-4］。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族成員，主要調節細胞凋亡，決定細胞的生存或死亡，可調控心梗后心衰促凋亡和抗凋亡［5］。活血益氣中藥對心梗后心衰具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不明確［6-7］。因此，本研究旨在探討早期應用活血益氣中藥抑制心梗后心衰大鼠左室重構和心肌細胞凋亡的作用特點。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 30只健康雄性清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質量（250±20）g。北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2011-0011。自然光線，分籠飼養，標準喂養。

1.2 試藥與儀器 活血益氣方：丹參15 g，川芎20 g，紅花15 g，黃芪20 g，赤芍10 g，黨參10 g。藥材均為筆者所在醫院中藥房提供，取處方藥材，加8倍量水煎煮2次，濾過，并制成生藥含量1 g/mL的煎煮液。卡托普利（廣東彼迪藥業有限公司），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），HE染色液（Sigma公司），VEGF、ET-1試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司，AngⅡ試劑盒購于北京富瑞生物工程公司。TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒美國eBioscience公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。OLYMPUSAU5400全自動生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；SMZ660熒光顯微鏡，日本尼康公司；Bioteka Quant型酶標儀，上海坤肯生物化工有限公司；DH-140B型小動物呼吸機，浙江醫科大學實驗儀器廠。

1.3 模型制備 40只SD大鼠飼養1周，水合氯醛麻醉大鼠后，固定于手術臺，碘酒消毒，在左胸第4肋骨間作橫切口，打開胸腔，使心臟充分暴露于外，剝離心包膜，冠狀動脈前降支起點處結扎前降支、心臟搏動稍減弱，心電圖出現ST段上抬，抬高到弓背向上為造模成功。逐層縫合皮膚，清除術野，關閉切口。腹腔注射青霉素3 d，200萬/（kg·d），預防感染［8-9］。假手術組大鼠手術過程同上，只穿線但不結扎冠脈。

1.4 分組與給藥 將模型大鼠隨機分為中藥組、西藥組和模型組，每組10只。中藥組給予活血益氣方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西藥組給予卡托普利灌胃，劑量為100 mg/kg，每日1次。對照組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。連續灌胃4周。

1.5 標本采集與檢測 采用小動物呼吸機檢測左室收縮內徑（LVS）、左室舒張內徑（LVD）、左室射血分數（EDV）和左室每搏輸出量（SV）。檢測完心功能后，剪開胸腔，迅速取出心臟，0.9%氯化鈉注射液清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。取血清，采用雙抗體夾心-ELISA法定量測定的VEGF、AngⅡ和ET-1水平，嚴格按照說明書操作。TUNEL試劑盒檢測心肌細胞凋亡，凋亡指數（AI）=凋亡心肌細胞數÷心肌細胞總數×100%。取心肌組織提取RNA，檢測提取的RNA純度，RNA經反轉錄后，采用RT-PPCR法檢測凋亡基因Bcl-2和Bax mRNA水平，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，據美國國立生物技術信息中心（NCBI）公布的大鼠Bcl-2和Bax基因序列，設計引物，引物序列見表1。95℃變性，60℃退火，40個循環。計3個復孔，以重水為陰性對照。根據標準曲線及待測樣本二階導數最大分析法計算的Ct值，計算mRNA含量。

表1 RT-PCR所用引物序列

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，t檢驗比較組內和組間差異，計數資料以n（%）表示，χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組大鼠病理組織比較 對照組心肌細胞正常，無壞死，模型組心肌細胞壞死，結締組織增生，中藥組和西藥組心肌細胞壞死減少，存在輕微結締組織增生。見圖1。

圖1 心肌組織病組織（HE染色，40倍）

2.2 各組大鼠心功能指標比較 見表2。中藥組和西藥組左室LVS和LVD顯著低于模型組，左室EDV和SV顯著高于模型組（P＜0.05）。

表2 各組心功能指標比較（±s）

表2 各組心功能指標比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 LVS（mm）0.73±0.09 0.57±0.04*0.39±0.05*△0.37±0.04*△LVD（mm）0.53±0.07 0.72±0.05*0.66±0.04*△0.65±0.04*△EDV（%）67.14±4.59 41.23±3.12*48.12±3.74*△46.43±3.62*△SV（mL）75.12±18.67 48.47±12.86*59.57±13.45*△61.15±12.56*△

2.3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較 見表3。中藥組和西藥組VEG、AngⅡ和ET-1水平顯著低于模型組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較（±s）

表3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較（±s）

組別對照組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 VEGF（pg/mL）142.14±22.34 243.21±42.49*167.19±21.35*△164.47±20.61*△AngⅡ（ng/mL）1.71±0.32 3.12±0.41*2.03±0.35*△1.98±0.31*△ET-1（%）45.37±7.24 68.47±8.26*52.12±6.21*△51.43±5.69*△

2.4 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI水平比較 見表4。中藥組和西藥組Bcl-2 mRNA水平顯著高于模型組Bax mRNA顯著低于模型組（P＜0.05），中藥組和西藥組AI顯著低于模型組，且低于對照組（P＜0.05）。

圖2 各組心肌細胞的凋亡情況（400倍）

3討 論

心肌梗死后左心室擴張和收縮功能障礙，冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，心肌細胞死亡伴隨有大量心肌細胞凋亡，心肌細胞肥大和間質增生，隨著病情的發展，心肌細胞凋亡持續存在，心肌細胞缺失和心室重構是心衰的主要原因［10-11］。心肌細胞凋亡激活神經內分泌系統，增加血清VEGF、AngⅡ和ET-1表達，促進心肌細胞肥大和膠原產生，體內水、鈉潴留，進一步損害心臟舒縮功能，導致心肌肥厚、心室重構和纖維化［12］。ET-1通過加重心臟負荷，損傷缺血再灌注，加重心肌缺血［13］。利尿劑是治療心衰的首選藥，可減輕體肺循環淤血及心臟前負荷，其不能被其他心血管藥物替代，常用藥物還有血管擴張劑、鈣增敏劑、促紅細胞生成素、內皮素Ⅰ拮抗劑等，藥品造價昂貴難以推廣［14］。中醫心衰屬于胸痹、痰飲、心水等范疇，心氣虛是其基本的病機，外因多為風、寒、濕、熱等，內因多為飲食失宜，臟腑內傷，本虛標實，本虛為氣虛為主，血瘀為其標，治宜活血益氣［15］。

本研究發現，對照組心肌細胞正常，無壞死，模型組心肌細胞壞死，結締組織增生，中藥組和西藥組心肌細胞壞死減少，存在輕微結締組織增生，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠病理組織，這與丹參可抑制心肌成纖維細胞分裂，川芎、紅花均活血化瘀，提高細胞內超氧化物歧化酶的生物活性，改善局部血液循環，抑制平滑肌細胞及成纖維細胞增生有關［16-17］。中藥組和西藥組左室LVS和LVD顯著低于模型組，左室EDV和SV顯著高于模型組，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠心功能。黃芪強心苷改善心室肌收縮和舒張，有效逆轉損傷心室，黨參、黃芪改善心臟的收縮、舒張功能，川芎、紅花抗凝、抗氧化、擴張血管、改善微循環以及保護血管內皮有關［18-19］。中藥組和西藥組VEGF、AngⅡ和ET-1顯著低于模型組，說明活血益氣中藥可降低心梗后心衰大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1表達。川芎促進心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生，減少左心室重構，改善心功能，提高心肌抗缺血能力，修復損傷心肌細胞，降低VEGF、AngⅡ和ET-1表達［20］。中藥組和西藥組Bcl-2 mRNA水平顯著高于模型組，Bax mRNA顯著低于模型組，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠凋亡基因。活血益氣方可抑制心肌細胞凋亡，促進心肌抗凋亡基因的表達，改善心功能，降低心肌細胞凋亡數。

表3 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比較（±s）

表3 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比較（±s）

組 別n Bcl-2 mRNA Bax mRNA AI（%）10 10 10 10對照組模型組中藥組西藥組1.00±0.14 0.15±0.03*0.51±0.06*△0.53±0.07*△1.00±0.09 1.69±0.11*1.17±0.09*△1.15±0.1*△15.12±2.24 71.47±5.26*46.12±4.37*△47.01±3.78*△

綜上所述，活血益氣中藥可抑制心梗后心衰大鼠左室重構和心肌細胞凋亡，可能與改善心功能、VEGF、AngⅡ和ET-1表達，調控心肌基因表達有關。