高效液相色譜法測定生物轉化反應液中N,N′-乙二胺二琥珀酸

吳智超, 吳恩國, 楊仲毅*, 陶宇翔, 陳 潭, 鐘永軍

(1. 臺州學院, 浙江 臺州 318000; 2. 浙江海正藥業股份有限公司, 浙江 臺州 318000;3. 臺州市博納化工有限公司, 浙江 臺州 318000)

乙二胺二琥珀酸(N,N′-ethylenediamine disuccinic acid, EDDS)是一種天然生物源氨基多羧酸類螯合劑,主要用于化妝品、洗滌劑,以及環保行業如重金屬污染土壤的修復等。與乙二胺四乙酸(EDTA)相比,EDDS具有更高的pH耐受性和更好的生物可降解性,是當前土壤修復研究中新一代生物螯合劑[1-4]。EDDS可以采用化學法、發酵法、生物轉化法進行生產[5],其中生物轉化法具有較好的環境兼容性,是國內外重點研發的方法。在生物轉化法中,EDDS裂合酶催化富馬酸與乙二胺,從而合成EDDS;反應過程中富馬酸也較容易形成副產物蘋果酸(見圖1)。

圖 1 EDDS的生物轉化Fig. 1 Biosynthesis of N,N′-ethylenediamine disuccinic acid (EDDS)

EDDS的快速分析是其當前研究、生產和應用的一項重要任務。EDDS的檢測方法主要有鈣螯合值法、比色法、離子色譜-電感耦合等離子體-質譜法、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)[6-8]。土壤修復中EDDS的檢測常用到離子交換色譜法和反相HPLC[6,9-11],其中反相HPLC檢測中,EDDS與流動相中的銅鹽形成EDDS-Cu絡合物,在254 nm處有較強吸收。EDDS生物轉化過程的監測,則要求能同時測定原料富馬酸、產物EDDS、副產物蘋果酸,檢測過程應簡單快速,并且最好能同時鑒別類似物如EDTA等物質,這也對檢測方法提出了更高的要求。富馬酸、蘋果酸等有機酸的常規檢測中,離子色譜法是常用的方法[12,13]。在EDDS生物合成研究中,Poddar等[14]采用核磁共振鑒定生成EDDS,并通過測定反應液在240 nm處紫外吸收的下降來判斷轉化過程中原料富馬酸的濃度變化。Witschel等[15]利用反相離子對色譜法測定反應生成的EDDS,并利用離子排阻色譜法檢測反應過程中蘋果酸和富馬酸的濃度。更多的報道[16,17]則是利用四丁基氫氧化銨作為反相離子對試劑,HPLC同時檢測反應過程中富馬酸和EDDS。Kato等[18]利用C8柱,同時測定富馬酸、L-蘋果酸和EDDS。

鑒于C18柱更廣泛的應用[19],建立基于C18柱能同時分析富馬酸、L-蘋果酸、EDDS的HPLC方法,并能同時測定產物的類似物EDTA及蘋果酸進入三羧酸循環后的典型代謝物檸檬酸的方法,將有利于EDDS生物合成研究的深入開展。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Micromass Quattro Micro API液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國Waters公司); LC3000型HPLC系統(北京創新通恒科技有限公司),包括P3000高壓輸液泵、UV3000紫外可見波長檢測、RPL-D2000型柱溫箱;UV-3300分光光度計(上海美譜達儀器有限公司); FA2004B十萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

甲醇為色譜純,由美國Fisher公司提供;富馬酸、L-蘋果酸、磷酸、25%(質量分數)四丁基氫氧化銨、乙酸銅為分析純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EDDS對照品由臺州市博納化工有限公司提供,含量為98.0%(質量分數)。

表達EDDS裂合酶的基因工程菌來自本實驗室。該酶的GenBank登錄號為ABG61966,是一種精氨琥珀酸裂合酶[14,20]。

1.2 實驗條件

1.2.1標準溶液的配制

稱取乙二胺二琥珀酸三鈉鹽固體粉末305.2 mg,加入約30 mL超純水,超聲5 min,用10 mol/L的氫氧化鈉溶液滴加并調節溶液的pH值至8.5,使EDDS溶解澄清,以去離子水定容至100 mL,得到EDDS標準儲備液。

稱取富馬酸固體粉末300 mg,加入約30 mL超純水,超聲5 min,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加并調節溶液的pH值至8.5,使富馬酸溶解澄清,以去離子水定容至100 mL,得到富馬酸標準儲備液。

1.2.2供試品溶液制備

EDDS的生物合成反應:在500 mL錐形瓶中加入富馬酸11.6 g、乙二胺鹽酸鹽6.7 g、氫氧化鎂2.9 g,以及去離子水50 mL、工程菌菌體5.0 g,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加調節溶液pH至8.8,用去離子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min條件在搖瓶中進行反應。取反應7 d的反應液作為樣品1;加入10 g/L的EDDS對照品于樣品1中,作為樣品2。

EDDS的水解反應:在500 mL錐形瓶中加入去離子水50 mL、EDDS 1.0 g,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加調節溶液至pH≈8.5,再加入工程菌菌體5.0 g,繼續以10 mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至8.5,并以去離子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min條件在搖瓶中進行反應,3 h后取樣作為樣品3。

1.2.3樣品處理

移取樣品1、2和3各1.0 mL,加入3 mol/L鹽酸200 μL終止反應,于5 min后加入3 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0～9.0,再用去離子水定容至20 mL,繼續用去離子水稀釋至適當濃度后,移取1.0 mL溶液,以10 000 r/min離心2 min,上清液待HPLC分析。

1.2.4色譜條件

色譜柱為InertSustain AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,日本島津公司);柱溫為30 ℃;流動相為25%(體積分數)甲醇水溶液(含1.0 g/L一水乙酸銅、2.0 g/L四丁基氫氧化銨,以磷酸調節pH值至2.80);流速為1.0 mL/min;進樣量為20 μL;檢測波長為254 nm。

1.2.5質譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI-)源;離子源溫度為100 ℃;脫溶劑溫度為300 ℃;毛細管電壓為3 200 V;錐孔電壓為20 V;氣簾氣為氮氣,流量為52 L/h;脫溶劑氣為氮氣,流量為650 L/h;檢測方式為全掃描,掃描范圍為m/z20～800;進樣方式為蠕動泵直接進樣。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇

在190～700 nm波段對0.5 g/L的EDDS溶液進行掃描,EDDS在195 nm處有最大吸收峰,而在250 nm之后則基本無吸收。在溶液中加入1 g/L的一水乙酸銅后再次掃描,EDDS-Cu復合物在190～285 nm處均有較高的吸收,并于320 nm左右降至接近基線。與EDDS不同,富馬酸的紫外吸收受乙酸銅的影響相對較小,其富馬酸-Cu復合物與EDDS-Cu復合物的掃描曲線基本重疊(見圖2)。實驗選擇254 nm作為HPLC的檢測波長,既保證了EDDS-Cu復合物有較高的紫外吸收,又可以避開游離EDDS對檢測的干擾。

圖 2 乙二胺二琥珀酸、富馬酸及其銅復合物的光吸收曲線Fig. 2 Absorbance curves of N,N′-ethylenediamine disuccinic acid, fumaric acid and their complex with copper salts

2.1.2流動相中甲醇體積分數的選擇

為開發一個快速簡便的HPLC方法,比較了流動相中甲醇的體積分數對出峰時間的影響(見圖3)。甲醇體積分數為15%時,EDDS、富馬酸和EDTA的出峰時間分別為7.5、10.1和11.8 min;甲醇體積分數為35%和50%時,EDDS和富馬酸的出峰時間雖然大為縮短,但EDTA出峰次序提前,且EDDS與蘋果酸、檸檬酸及EDTA不能有效分離,不利于副產物和其他雜質的分離檢測;甲醇體積分數為25%時,EDDS、富馬酸及蘋果酸、檸檬酸和EDTA可基線分離,峰形均較對稱，其出峰時間分別為3.3、3.7、4.2、5.2和6.1 min,總出峰時間在8 min以內,且在254 nm處均有較為適中的光吸收,較有利于樣品的快速檢測。

圖 3 流動相中甲醇體積分數對HPLC分析的影響Fig. 3 Effect of volume fractions of methanol in the mobile phases on HPLC analysis 1. malic acid; 2. citric acid; 3. EDDS; 4. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 5. fumaric acid.

2.1.3方法的適用性

EDDS、富馬酸及蘋果酸、檸檬酸和EDTA這5種物質的快速分離使得本方法適用于EDDS的多個研究領域。比如在EDDS的生物轉化和發酵法生產過程中,除了原料富馬酸、產物EDDS外,富馬酸在微生物富馬酸酶的催化下會產生副產物蘋果酸(見圖1),蘋果酸和富馬酸進入三羧酸循環后容易產生檸檬酸,因而本方法可以用于生物轉化和發酵法生產EDDS的檢測;在工藝過程中混入EDTA還會影響EDDS的產品質量,在土壤修復的研究中需要對比EDTA和EDDS等不同螯合劑的效果,本方法也能有效區分EDDS和EDTA。

2.2 方法線性范圍、檢出限、精密度及回收率

2.2.1線性范圍和檢出限

精密吸取EDDS和富馬酸標準儲備液,用去離子水稀釋成0～3 g/L的系列標準工作液,進行HPLC分析。EDDS和富馬酸的質量濃度與峰面積的關系見圖4。

圖 4 EDDS與富馬酸的質量濃度-峰面積關系曲線Fig. 4 Mass concentration-peak area curves of EDDS and fumaric acid

從圖4可見,EDDS在含量較低時峰面積與質量濃度之間的線性關系較為明顯,隨著質量濃度的升高,其線性關系降低。EDDS在0.06～0.6 g/L范圍內呈現較好的線性關系,以峰面積為縱坐標(Y)、質量濃度為橫坐標(X, g/L)繪制標準曲線,其回歸方程為Y=11 583.0X+123.1,相關系數(r)為0.999 5。

樣品中EDDS最大允許質量濃度可以根據流動相中銅離子的質量濃度進行估算。在254 nm處,EDDS基本沒有光吸收,峰面積主要由EDDS-Cu復合物引起。本文中流動相銅離子濃度為0.5 mmol/L,銅離子與EDDS等物質的量形成復合物,則相應色譜峰中EDDS最高濃度也是0.5 mmol/L。在甲醇體積分數為25%的流動相中,EDDS峰洗脫液體積為400 μL, HPLC進樣體積為20 μL,將EDDS峰形近似作為三角形進行估算,則可計算得到樣品中EDDS的最大允許質量濃度為1.791 g/L。即樣品中EDDS質量濃度超過1.791 g/L時將導致HPLC流動相中無足夠銅離子與EDDS形成復合物。這與本實驗結果基本吻合,當EDDS質量濃度高于1.8 g/L,HPLC的峰面積增長已趨于非常緩慢的狀態(見圖4)。

與EDDS不同,富馬酸在反相柱上的分離并不依賴銅復合物的形成,銅離子的存在不影響富馬酸的紫外吸收。在0.06～1.8 g/L范圍內,富馬酸的質量濃度與峰面積具有較好的線性關系,其回歸方程為Y=5 013.6X+28.9,r為0.999 5。

通過逐步稀釋標準溶液,獲得EDDS和富馬酸的檢出限(S/N=3),分別為0.98 mg/L和1.32 mg/L。

2.2.2精密度和穩定性

對0.6 g/L的富馬酸和EDDS樣品進行分析,各連續進樣6次,記錄峰面積,計算得富馬酸和EDDS峰面積的RSD分別為0.85%和1.12%(n=6),表明儀器精密度良好。

取樣品2進行稀釋,分別于0、2、4、6、8、10 h進樣測定,記錄峰面積,計算得到EDDS和富馬酸峰面積的RSD分別為0.41%和1.73%(n=6)。結果表明,供試品溶液在10 h內穩定。當供試品溶液繼續放置20 h和24 h時,EDDS和富馬酸峰面積的RSD分別為0.70%和3.48%(n=8),說明EDDS依然相對穩定,而富馬酸則相對變化較大。

2.2.3回收率

在未添加工程菌的EDDS合成反應液中加入EDDS和富馬酸標準品,測定并配制成質量濃度均為5 g/L的EDDS和富馬酸混合溶液。取該溶液18份,每份精密量取1.0 mL,分為3組,每組按低、中、高水平分別精密加入相當于3.92、4.90、5.88 g/L的EDDS或富馬酸標準品,測定并計算回收率(見表1)。結果表明該方法準確性良好。

表 1 EDDS和富馬酸在3個水平下的加標回收率(n=9)

2.3 EDDS生物合成和水解反應樣品的測定

按照1.2.2和1.2.3節方法制備供試品溶液并處理樣品,按1.2.4節色譜條件對樣品1進行測定。結果表明,富馬酸殘留為7.22 g/L,但產物EDDS含量僅為0.25 g/L,副產物蘋果酸達到了36.56 g/L。將該樣品進行質譜分析,質譜圖中m/z為133的信號較高,進一步證實該副產物為蘋果酸(見圖5)。

圖 5 EDDS生物合成樣品的色譜圖和質譜圖Fig. 5 Chromatogram and MS spectrum of the EDDS biosynthesis sample

上述HPLC測定結果表明,該基因工程中的EDDS裂合酶催化EDDS合成活性較低。由于該酶催化的反應為可逆反應,為驗證該基因工程菌表達的酶是否有活性,重新設計了以EDDS為底物的水解反應。以10 g/L EDDS為底物,經過工程菌水解3 h,得到樣品3,并進行測定,測得蘋果酸、EDDS的含量分別為3.05 g/L和6.76 g/L,未能檢測到典型的富馬酸峰。由于EDDS需要先在EDDS裂合酶催化下形成富馬酸,再在富馬酸酶作用下形成蘋果酸(見圖1),因而推測該基因工程菌表達的EDDS裂合酶具有催化活性,同時該工程菌宿主菌中具有較高的富馬酸酶活性。

3 結論

本文建立的反相離子對色譜法可以快速同時分離蘋果酸、檸檬酸、EDDS、EDTA和富馬酸,為EDDS生物合成機理和工藝開發提供了有效的分析技術支持。

致謝 本文的質譜分析得到普濟生物科技(臺州)有限公司徐剛博士的支持。